Почему для коагуляционных тестов

ИСПОЛЬЗУЕТСЯ НЕ СЫВОРОТКА, А ПЛАЗМА КРОВИ?

Образец крови это кровь, полученная от пациента Это может быть ве­нозная, артериальная или капиллярная кровь.

Исследуемый образец это материал, полученный после специальной об­работки образца крови Это может быть кровь, сыворотка или плазма.

Для получения сывортки кровь забирается без какого либо антикоагулянта. Сыворотка это жидкость, остающаяся после свертывания и отделения клеточных компонентов крови.

Для получения плазмы при заборе крови в пробирку добавляется антикоа­гулянт. Плазма это жидкость, полученная после отделения клеточных компо­нентов без предварительного свертывания Для коагуляционных тестов используется плазма, т.к. сыворотка не позволяет воспроизвести реальную ситуацию свертывания крови по следующим причинам:

• сыворотка не содержит фибриноген Это значит, что образование фибринового сгустка, что является конечной точкой для большинства коагуляци онных тестов, невозможно

• сыворотка не содержит II, VII, VI, XIII факторы, или они присутствуют в сле­довых количествах.

В качестве образца сыворотка используется в исключительных случаях, когда компоненты плазмы могут повлиять на результаты теста, например при выполнении тестов на продукты деградации фибрина / фибриногена с использованием первых тест-систем

В прошлом, факторы свертывания, присутствующие как в сыворотке, так и в плазме (VII, IX, X, XI, XII) исследовались как в сыворотке, так и в плазме Однако, их определение в сыворотке было отвергнуто вообще, частично из-за плохой воспроиз­води­мости, частично из-за более сложной процедуры ис следования (сложная допол­нительная активация, приготовление в качестве стандарта пула сывороток).

3.4. ЧТО ЯВЛЯЕТСЯ АНТИКОАГУЛЯНТАМИ И КАКИЕ АНТИКОАГУЛЯНТЫ ИСПОЛЬЗУЮТСЯ СПЕЦИАЛЬНО ДЛЯ КОАГУЛОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ?

Множество лабораторных тестов выполняется не из сыворотки, а из цель­ной крови или из плазмы Это касается не только коагулологических тестов, но также и гематологических и некоторых биохимических или иммунохимических исследований.

Кровь может быть сохранена в жидком состоянии добавлением антикоагулянтных веществ, т.е. веществ предотвращающих свертывание:

• Цитрат (Nа₃С₆Н₆O₇ х 2 Н₂О). Предотвращает свертывание за счет связывания ионов кальция

• Оксалат (натрия или калия). Тот же механизм как и у цитрата.

• ЭДТА (натриевая или калиевая соль). Тот же механизм как и у цитрата.

• Флуорид (натриевая соль) Тот же механизм как и у цитрата.

• Гепарин (гепаринат натрия, лития или аммония). Предотвращает свертывание за счет катализации ингибирования факторов сверытывания антитромбином III.

Полное описание исследуемого образца, полученного с добавлением антикоагулянта, должно также включать в себя и название антикоагулянта, на пример цитратная кровь, нитратная плазма, ЭДТА плазма Это необходимо, потому что не любая жидкая кровь или плазма годна для выполнения требуемых лабораторных тестов. Ниже приведены антикоагулянты, пригодные для выполнения тех или иных лабораторных тестов.

• цитрат, оксалат - коагуляционные тесты

• ЭДТА - гематологические тесты

• флуорид - глюкоза

• гепарин - КЩС, различные ферменты и метаболиты

Коагуляционные тесты практически всегда выполняются в нитратной или оксалатной плазме. Хотя оксалат в принципе годен для выполнения коагулологических тестов, он крайне редко используется, так как по сравнению с цитра­том, он хуже связывает ионы кальция и влияет на стабильность V фактора.

ЭДТА, флуорид и гепарин не пригодны для выполнения коагуляционных те­стов, т.к:

• ЭДТА ведет к инактивации VI и VIII факторов,

• флуорид ингибирует гликолив в тромбоцитах,

• гепарин ведет к появлению таких комплексных нарушений, что невозмож но оценить реальное состояние гемостаза.

3.5. какова ПРАВИЛЬНАЯ ПРОЦЕДУРА ВЗЯТИЯ КРОВИ ДЛЯ КОАГУЛОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИИ?

Место: Кровь забирается из переферической, обычно кубитальной, вены Антикоагулянт: Венозная кровь забирается в 0.105 М (3,2%) цитрат на­трия в соотношении 1:10 (1 часть цитрата на 9 частей крови). В настоящее время широко используется также 0.129 М (3,8%) цитрат натрия, но пока не доказано, что он пригоден для всех видов коагулологических исследований.

Методы забора-

• "бабочкообразная " игла- кровь забирается в силиконизированную градуи­рованную стеклянную центрифужную пробирку, или градуированную пласти­ковую пробирку, содержащую антикоагулянт, с использованием "бабочко-образной" иглы.

• Шприц - кровь берется в градуированный пластиковый шприц, содержащий антикоагулянт.

• Моноветт (аспирационный метод) коммерческая аспирационная система (градуированный шприц), содержащая раствор цитрата натрия.

• Вакутейнер (вакуумный метод) коммерческая система (пробирка с опреде­ленным отрицательным давлением), содержащая раствор цитрата натрия.

Процедура

• Компрессия - Для венозной компрессии жгут или манжетка налагается не более чем на 60 сек. Потенциальные источники ошибок: если жгут наложен на слишком длительное время или с избыточным давлением, это может ве­сти к локальной активации фибринолиза и, таким образом, к возрастанию активности факторов свертывания (3 12)

• Венопунктура - после дезинфекции кожи вена пунктируется канюлей, соот­ветствующей технике забора. Потенциальные источники ошибок: в случае "трудных" вен и длительных попыток пунктирования. в канюлю попадает большое количество тканевой жидкости.

• Выбрасывание первой порции крови - первая порция крови после прокола вены должна быть выброшена, или должна использоваться для других ви­дов исследования. Источники ошибок: содержащаяся в первой порции крови тканевая тромбокиназа может влиять на результаты исследований.

• Т ок крови - важно убедиться, что канюля находится в вене так, что ничего не препятствует свободному току крови. Кровь должна течь быстро и само теком. Потенциальные источники ошибок: если кровь аспирируется слишком быстро, это может повредить тромбоциты (ведет к их функциональным изменениям и высвобождению БАВ) или эритроциты (гемолиз); если кровь аспирируется слишком медленно, может иметь место частично свертыва ние крови с образованием как видимого, так и невидимого сгустка; если аспирируется слишком мало крови, то не соблюдается соотношение кровь/цитрат, и результаты будут неправильными.

• Перемешивание - кровь должна быть перемешана с цитратом сразу же после взятия.

3.6. ЧТО ЯВЛЯЕТСЯ ИССЛЕДУЕМЫМ ОБРАЗЦОМ ДЛЯ КОАГУЛОЛОГИЧЕСКИХ ТЕСТОВ?

Цитратная кровь - без последующей обработки цитратная кровь используется в настоящее время только для определения времени рекальцификации или активированного времени рекальцификации.

Цитратная плазма получается центрифугированием из цитратной крови

• Цитратная плазма богатая тромбоцитами - кровь центрифугируется в тече­ние 5 мин. при 100 g, что равно примерно 800 об/мин стандартной на стольной центрифуги. Торможение центрифуги должно быть плавное, чтобы не допустить перемешивания. Супернатант используется для исследования функции тромбоцитов.

• Цитратная плазма, бедная тромбоцитами кровь центрифугируется 10 мин при 1500-2000g, (примерно 3000 об/мин). Этот материал, называемый плазмой, используется для большинства коагуляционных тестов. В такой плазме тромбоциты еще содержатся, но в малых количестах. • Бестромбоцитная плазма - центрифугирование 30 мин. (или 20 мин для

плазмы, бедной тромбоцитами) не менее чем при 2500g (примерно 4000 (об/мин). Используется для тех же целей. Если необходимо морозить мате­риал, то нужно замораживать бестромбоцитную плазму.

Капиллярная кровь (см.п. 3.8)

Сыворотка (п. 3.3)

ЭДТА кровь используется для гематологических исследований, подсчета тромбоцитов.

3.7. когда НУЖНО ЗАБИРАТЬ КРОВЬ В СТАД ПРОБИРКИ?

СТАД пробирки представляют собой коммерческие коллекционные пробирки, содержащие цитрат натрия (0.105 М), теофиллин, аденозин и дипиридамол. Три последние вещества предотвращают активацию тромбоцитов за счет повышения концентрации цАМФ (циклоаденозинмонофосфата). Это препятствует как агрегации тромбоцитов, так и высобождению БАВ, например тромбоцитарных факторов свертывания. Забор крови в СТАД пробирки рекоменодован для всех тестов, где важно избежание высвобождения тромбоцитарных факторов в период времени ме-

жду забором крови и выполнением исследования. "Стабилизация" тромбоцитов за счет СТАД предотвращает искусственное высвобождение тромбоцитарных факторов в плазму и "фальсификацию" результатов теста.

Искусственная контаминация компонентами тромбоцитов влияет на ре зультаты следующих тестов:

• Определение факторов тромбоцитов - фактор тромбоцитов (PF4, антигепа рин) и р тромбоглобулин являются специфическими белками тромбоцитов. Определение этих факторов в плазме позволяет выяснить уровень активации тромбоцитов in vivo. В случае активации тромбоцитов в пробирке ре зультаты теста могут оказаться искусственно завышенными

• Определение гепарина - PF4 представляет собой протеин, который нейтрализует как нефракционированный, так и низкомолекулярный гепарин. Не обходимо избегать высвобождения этого фактора после забора крови у па циентов, получающих гепаринотерапию, особенно в случае низкодозовой профилактики, так как в противном случае будут определяться ложно зани женные величины гепарина, а АПТВ и ТВ могут быть ложно нормальными

• Определение ингибитора активатора плазминогена (РА1-1) - РА1-1 синтезируется как в эндотелиальных клетках, так и в мегакариоцитах, и таким образом присутствует в высоких концентрациях в тромбоцитах. Стабилизация СТАД предотвращает высобождение РА1-1 в плазму и таким образом воз можно получить правильное представление о функции фибринолитической системы.

Примечания:

• СТАД пробирки существуют в виде вакутейнеров

• Пробирка после взятия крови должна немедленно помещаться в ледяную баню

• Образцы должны центрифугироваться в криоцентрифуге (+2 - +8°С)

• Другие коагуляционные тесты (скрининговые тесты и исследования отдельных факторов свертывания) могут выполняться из СТАД плазмы также как и из цитратной плазмы.

Какие ТЕСТЫ МОЖНО ВЫПОЛНЯТЬ ИЗ КАПИЛЛЯРНОЙ КРОВИ И КАК ЗАБИРАТЬ КАПИЛЛЯРНУЮ КРОВЬ?

Для большинства коагуляционных тестов капиллярная кровь является не подходящим материалом, так в этом случае возрастает риск активации свер ывания и разведения пробы тканевой жидкостью

Для избежания неверных результатов капиллярная кровь может использоваться только для некоторых специально адаптированных методов, таких как:

• подсчет тромбоцитов

• определение времени кровотечения

• определение протромбинового времени (п. 3.39, 3.40)

• определение АПТВ (п.3.40)

Определение протромбинового времени в капиллярной крови (например с использованием Hepato Quick теста) особенно часто используется для долговременного мониторинга терапии оральными антикоагулянтами, а также у детей.

Определение АПТВ в капиллярной крови используется исключительно для мониторинга гепаринотерапии

Забор капиллярной крови (в соответствии со стандартом DIN 58910-D) Чистое и сухое место кончика пальца или ушной мочки пациента пунктиуется стерильным скарификатором Прокол должен быть достаточно глубоким для того, чтобы кровь текла самотеком. Недопустимо давление или сжатие. Для исследования используются первые несколько капель крови.

Необходимое количество крови (10-50 мкл) забирается в стерильный капилляр в течение 10 сек. Капилляр держится горизонтально, один его конец касается места прокола

Забор цитратной капиллярной крови

Для получения цитратной капиллярной крови, кровь должна быть перемешана с цитратом во время или сразу после забора. Цитратная кровь может быть использована для определения протромбинового времени тестом Hepato Quick.