Гибридизация в-лимфоцита с клеткой миеломы

Отцы гибридомной технологии Келер и Мильштейн добивались слияния клеток при помощи вируса Сендай. Сейчас для этой цели все используют полиэтиленгликоль (ПЭГ), как более удобное, эффективное и безопасное средство. Формула ПЭГ:

HO(CH2CH2O)n CH2CH2OH, молекулярный вес ПЭГ, пригодного для слияния, от 20 до 20000, но чаще используют ПЭГ массой 600-6 000.

Полиэтиленгликоль токсичен для клеток, и его токсичность возрастает с уменьшением молекулярного веса. Слияние клеток происходит во время инкубации их в 35-50% ПЭГ, время инкубации зависит от концентрации ПЭГ и от его молекулярного веса (для 50% ПЭГ мол. веса 1 500 это приблизительно 1 минута). Недостаточное время инкубации приведут к очень низкому проценту слившихся клеток, а избыточное- к большому проценту погибших клеток вследствие токсичности ПЭГ. Хорошо работает такой компромиссный вариант, когда клетки сначала инкубируются при мягком перемешивании в 50% ПЭГ в течение 1 мин, затем процент ПЭГ снижается до 35% медленным добавлением бессывороточной среды, и клетки инкубируются еще 5-7 минут. Затем медленно, но с нарастающим темпом и при аккуратном перемешивании суспензия клеток далее разбавляется средой, потом центрифугируется и высевается на культуральные планшеты.

Точный механизм гибридизации клеток еще недостаточно изучен. Вначале, по-видимому, происходит агглютинация (склеивание) клеток, затем слияние клеточных мембран и, наконец, слияние ядер и перестройки хромосомного материала. Имеются данные, что сливаются, в основном, клетки, находящиеся в стадии интенсивного деления. По этой причине клетки миеломы за 12-24 часа до гибридизации переводят в условия, способствующие максимальной скорости роста клеток (повышение содержания фетальной сыворотки, витаминов и ростовых факторов в культуральной среде). Иммунизация в свою очередь стимулирует рост клонов В-лимфоцитов- продуцентов специфических к антигену антител.