Цитогенетическим маркером хронического миелолейкоза (ХМЛ) служит Ph-хромосома (Филадельфийская хромосома), которая возникает за счет обмена генетическим материалом
Рисунок 35.Схема ПЦР
между хромосомами 9 и 22. В результате транслокации на 22-й хромосоме возникает новый ген BCR-ABL, кодирующий белок, представляющий собой тирозинкиназу с повышенной активностью. Симптомы заболевания - нейтрофильный лейкоцитоз со сдвигом лейкоцитарной формулы до миелоцитов и промиелоцитов, спленомегалия, астения, обусловленная повышенным клеточным распадом, который может сопровождаться гиперурикемией. В типичных случаях гематолог легко ставит диагноз ХМЛ, но иногда клинико-гематологическая картина не типична и требуется подтверждение диагноза.
Опишите молекулярно-генетический метод, с помощью которого можно подтвердить диагноз ХМЛ.
Для этого:
а) объясните, как можно получить большое число копий гена в условиях репликации in vitro при очень малых количествах исходной ДНК в образце; приведите схему этого процесса;
|
|
б) перечислите, какие компоненты содержит реакционная смесь;
в) изложите, какова функция праймеров;
г) поясните, каким способом можно выявить мутацию в амплифицированном участке ДНК.
ОТВЕТ:
а)Большое число копий гена можно получить методом ПЦР.
б) Компоненты реакционной смеси: исследуемая ДНК, 4 dNTP, 2 праймера, термостабильная, или Taq-полимераза, буфер, содержащий ионы Mg2+.
в) Праймеры – это короткие олигодезоксирибонукеотидные последовательности длиной от 15 до 30 пар нуклеотидов, которые комплиментарны 3’-концам амплифицируемого участка на нитях ДНК. Расстояние между праймерами определяет длину синтезируемых фрагментов молекулы ДНК.
г) Образцы с амплифицированным фрагментом ДНК, предположительно содержащим мутацию, наносят на узкие полоски нитроцеллюлозы и обрабатывают меченными олигонуклеотидами (32Р-зондами), содержащими нормальную и мутантную последовательности. Радиоавтографически оценивают, с какими 32Р-зондами связывается ДНК пациента. Гибридизация с радиоактивно меченым зондом ‒ наиболее чувствительный метод индикации. Кроме данного метода, в диагностической практике используют электрофорез в агарозном геле с окрашиванием бромистым этидием и ДНК-гибридизацию с последующей индикацией с помощью ферментативной и люминисцентной меток.