Работа №2 Определение содержания альбумина в сыворотке крови по реакции с бромкрезоловым зеленым

Прuнцuп метода. При взаимодействии альбумина с БКЗ образуется ком­плекс синего цвета, интенсивность окраски которого прямо пропорциональна содержанию альбумина.

Реактивы

1. Уксусная кислота, моль/л. В мерную колбу емкостью 1 л помещают 60 мл ледяной уксусной кислоты и доводят объем дистиллированной водой до метки.

2. Едкий натр, ч.д.а., х.ч., моль/л.

3. Ацетатный буфер, 0,05 моль/л, рН 4,2, с добавлением детергента. 0,85 г полигидроксиэтиленлаурилового эфира (Brij-35) растворяют в 200 мл дистиллированной воды, добавляют 50 мл моль/л раствора уксусной кислоты, 13,2 мл моль/л раствора едкого натра и доводят объем дистил­лированной водой до 1 л. Перемешивают, проверяют рН. Реактив стаби­лен при хранении в холодильнике.

4. Бромкрезоловый зеленый водорастворимый, ч.д.а. - индикатор, 1,2 ммоль/л. 0,4292 г БКЗ растворяют в 200-300 мл дистиллированной во­ды в мерной колбе на 500 мл и доводят объем до метки. Реактив стаби­лен при хранении в холодильнике в посуде из темного стекла.

5. Рабочий раствор БКЗ в ацетатном буфере. В мерную колбу емкостью 1 л помещают 85 мл 1,2 ммоль/л раствора БКЗ, доводят объем до метки аце­татным буфером с детергентом. Раствор стабилен при хранении в холо­дильнике в посуде из темного стекла.

6. Основной калибровочный раствор альбумина, 100 г/л. Может быть исполь­зован амnyлированный 10% раствор альбумина плацентарного.

Ход определения. Опытная проба. 10 мкл сыворотки крови (или 0,1 мл сыво­ротки, разведенной в 10 раз 9 г/л раствором NaCl) тщательно перемешивают с 4 мл рабочего раствора БКЗ в ацетатном буфере, избегая образования пены. Через 5-1О мин измеряют абсорбцию раствора на фотоэлектроколориметре в кю­вете с толщиной слоя 1 см при длине волны 590-700 нм (красный светофильтр) против холостой пробы на реактивы или на спектрофотометре при длине вол­ны 625 нм в кювете с толщиной слоя 1 см. Окраска стабильна в течение 8 ч.

Холостую пробу ставят как опытную, но вместо сыворотки добавляют 0,1 мл дистиллированной воды.

Расчет ведут по калибровочной кривой. Для ее построения готовят ряд разведений основного раствора.

Калибровочные растворы обрабатывают как опытные, но вместо сыворотки используют 10 мкл (или 0,1 мл разведенного в 10 раз) калибровочного раствора. Калибровочная кривая линейна до концентрации 60 г/л.

Норма: 30-50 г/л для практически здоровых взрослых людей. Содержание альбумина в плазме (сыворотке) крови детей в возрасте 0-1 мес составляет 31-44 г/л.