Праймеры

Требуется подобрать фрагмент молекулы ДНК таким образом, чтобы два его концевых участка, находящиеся на расстоянии от 300 до 10000 нуклеотидов друг от друга (для удобной детекции), отличались генетической консервативностью и присутствовали только у интересующего вида микроорганизмов или в исследуемом гене человека.

Проделать эту работу позволяют с пециальные компьютерные программы, использующие информацию о нуклеотидной последовательности известных микроорганизмов и человека.

Длина праймеров обычно составляет 20-30 нуклеотидов. Место их присоединения к ДНК-матрице не должно находиться внутри стабильной шпилечной структуры, которая возникает при наличии стабильных инвертированных повторов, или рядом с ней. На 3'-конце праймера не должно быть подряд более трех G и С. Также следует исключить комплементарность 3'-концов праймеров друг другу. Содержание (G+C) в структуре выбирают в интервале 50-60%, что создает предпосылки для высокой температуры отжига.

Праймеры должны иметь одинаковые температуры плавления (диапазон разброса не более 2ºС).

T_пл = 2(А+Т) + 4(G + С)

Зависимость используется для коротких (длиной до 20 нуклеотидов цепей). Для праймеров большей длины реальная температура плавления ниже на 5-10ºС.

Дезоксирибонуклеозидтрифосфаты

Их водные растворы (рН = 7-8) хранят при температуре -20ºС. Рабочие растворы 0.5-10мМ готовят разбавлением растворов стерильной бидистиллированной или деионизированной водой.

Избыток дНТФ приводит к снижению специфичности и эфективности реакции.

Taq-полимераза

Фермент Taq-полимераза (термостабильная ДНК-полимераза, катализирующая удлинение цепей праймеров путем последовательного присоединения нуклеотидных оснований к растущей цепи синтезируемой ДНК). Taq-полимеразы получена из термофильных бактерий Thermis aquaticus, оптимум работы фермента находится в области 70-72°С

Ионы двухвалентных металлов:

Ионы Mg²⁺ являются необходимым кофактором для ДНК-полимеразы. Компоненты реакционной смеси связывают ионы Mg²⁺, поэтому, чтобы создать оптимальный избыток несвязанного иона, проводится оптимизация для выбранных концентраций ДНК-матрицы, праймера, дНТФ и ДНК-полимеразы путем изменения концентрации Mg²⁺ в интервале 1-4 мМ

В зависимости от используемого буфера ионы вносят в виде хлорида, сульфата или ацетата

При проведении сайт-направленного мутагенеза добавляют ионы Mg²⁺, т.к. они приводят к снижению точности копирования.