Условия эффективной экспрессии

1) гены клонируются в многокопийных векторах, т.к. при этом целевой ген будет находиться в клетке в большом количестве.

2) кодирующая последовательность ДНК находится под контролем промотора, который эффективно узнаётся РНК-полимеразой клетки,

3) образующаяся мРНК относительно стабильна и эффективно транслируется.

4) образующийся чужеродный белок не должен подвергаться быстрой деградации внутриклеточными протеазами.

При создании трансгенных животных и растений часто добиваются тканеспецифичной экспрессии вводимых целевых генов. Любой полноценный ген состоит из двух основных частей – регуляторной и структурной. Регуляторная часть распознается соответствующими ферментными системами организма и обеспечивает упорядоченную экспрессию его структурной части. Она высокоспецифична в отношении своих природных эффекторов (РНК-полимераз, рибосом, факторов транскрипции и трансляции, факторов сплайсинга и т.д.). Чаще всего регуляторная часть не может функционировать в другом генетическом окружении.

Генетическая информация передается по схеме ДНК → (транскрипция) РНК → (трансляция) белок. Это необходимые этапы для экспрессии рекДНК.

Экспрессия эукариотических генов в бактериальной клетке является фундаментальным вопросом биологии. Так как генетический код универсален, то возможность такой экспрессии определяется:

Возможность экспрессии эукариотического гена в прокариотической клетке определяется

1) наличием в изучаемом гене сигналов инициации и терминации транскрипции и трансляции

2) правильное узнавание их прокариотической клеткой

Основные отличия систем экспрессии про- и эукариот:

1) большинство генов высших эукариот имеет прерывистую экзон-интронную структуру, в результате транскрипции таких генов образуется матричная РНК–предшественник (пре-мРНК), из которой при последующем сплайсинге выщепляются некодирующие последовательности – интроны, и образуется зрелая мРНК. Такие гены не могут экспрессироваться в клетках бактерий, где отсутствует система сплайсинга. Эукариотические гены, имеющие непрерывную кодирующую последовательность, иногда способны правильно экспрессироваться в клетках бактерий.

2) У прокариот существует одна РНК-полимераза, синтезирующая все типы РНК. У эукариот существуют три типа РНК-полимераз:

РНК-полимераза I (синтезирует рибосомные РНК)

РНК-полимераза II (матричные РНК)

РНК-полимераза III (транспортные РНК)

3) Различия по использованию кодонов, терминирующих трансляцию: в эукариотических мРНК используются все три терминирующих кодона, а в прокариотических – только один.

4) Различия в последовательностях мРНК, необходимых для инициации трансляции

5) Различные последовательности, ответственные за связывание транскриптов с рибосомальными РНК

Автономная экспрессия клонированного гена возможна только в случае, если инициация и терминация транскрипции происходит полностью на клонируемом фрагменте. В таком случае экспрессия гена не зависит от типа вектора и ориентации в нем встроенного фрагмента ДНК.

При инициации транскрипции на промоторе вектора синтез полноценного белка, детерминируемого клонированной последовательностью, возможен только при наличии в транскрипте участка связывания бактериальной рибосомы.