double arrow

Установление экспрессии эукариотических генов в E. coli


1) функциональная комплементация (штамм E. coli, ауксотрофный по гистидину)

2) селективные питательные среды: бактерии не способны расти на питательной среде, содержащей крахмал к качестве единственного источника углерода. В плазмиду рВR322 встроили фрагменты хромосомной ДНК дрозофилы и осуществили трансформацию клеток E. coli гибридными ДНК. Среди трансформантов выявлены клоны, растущие на крахмале. Синтезируемая в E. coli α-амилаза соответствует по своим свойствам данному ферменту дрозофилы.

Клонирование мозаичных генов высших эукариот в клетках E. coli

1) С помощью обратной транскриптазы на молекулах мРНК синтезируется кДНК

2) Достраиваются вторые цепи на кДНК, в результате чего образуются двухцепочечные ДНК-копии мРНК

3) Фрагменты ДНК встраиваются в подходящий клонирующий вектор коннекторным методом или с помощью синтетических линкеров

4) рекДНК вводится в E. coli

К генам, способным эффективно экспрессироваться в эукариотических клетках, относят гибридные гены.Этогены, у которых кодирующая последовательность представлена эукариотической кДНК, а сигналы инициации транскрипции и трансляции имеют бактериальное происхождение.




Пример:

1) Экспрессирующий вектор + фрагмент гена lacZ, содержащий промотор, участок связывания рибосом и триплеты нескольких первых аминокислот β-галактозидазы E. coli, которые задают рамку трансляции клонированной последовательности. При совпадении рамок трансляции β-галактозидазы и клонированной ДНК в бактериальных клетках синтезируется эукариотический белок, содержащий на N-конце дополнительно несколько аминокислот β-галактозидазы. Продукт экспрессии рекДНК представляет собой химерный белок.

2) Плазмида pBR322, в которую по PstI участку встроили кДНК проинсулина крысы в составе гена β-лактамазы. При совпадении рамок трансляции E. coli синтезирует химерный белок, содержащий антигенные детерминанты как инсулина, так и β-лактамазы.

Целевой белок из состава химерного можно извлечь с помощью соответствующих протеаз.







Сейчас читают про: