double arrow

Метод Максама-Гилберта

Используется для секвенирования одно- и двухцепочечных фрагментов ДНК.

Этапы метода:

1) специфическая химическая фрагментация изучаемого полинуклеотида

2) фрагмент ДНК метят радиоактивным изотопом 32Р по 5'- или 3'-концу. У двухцепочечной ДНК метятся обе цепи

3) Подготовка меченных фрагментов к секвенированию. Для этого используются клонирующие векторы, содержащие синтетические полилинкеры. После гидролиза рестриктазами, образующими липкие концы, с помощью фрагмента Кленова избирательно метят клонированные фрагменты по одному концу.

4) Меченные фрагменты делят на порции и каждую подвергают определенной химической модификации. Ее проводят так, чтобы на одну молекулу ДНК в среднем приходилось по одной метке.

Пуриновые основания: диметилсульфат – метилирование аденина по положению N3, гуанина – N7. Обработка 0,1М HCl при температуре 0ºС приводит к отщеплению метиладенина. Инкубация при 90ºС в щелочной среде (0,1М NaOH) вызывает разрыв цепи ДНК в местах отщепления оснований. При обработке пиперидином происходит гидролиз цепи ДНК по остаткам метилгуанина.

Пиримидиновые основания: гидразин. Если реакцию вести в бессолевой среде, то модифицируются тимин и цитозин, а в присутствии 2М NaCl – только цитозин. При обработке пиперидином происходит гидролиз цепи ДНК пр точкам модификации

5) После параллельного проведения четырех различных обработок фрагмента ДНК полученные субфрагменты разделяют путем электрофореза в полиакриламидном геле на соседних дорожках

6) С помощью радиоавтографии геля на рентгеновской пленке считывается нуклеотидная последовательность ДНК

Экспрессия в клетках бактерий рекомбинантных ДНК

Одна из важнейших задач генной инженерии – создание штаммов бактерий или дрожжей, линий клеток тканей животных или растений, а также трансгенных растений и животных, которые обеспечивали бы эффективную экспрессию клонируемых в них генов.


Понравилась статья? Добавь ее в закладку (CTRL+D) и не забудь поделиться с друзьями:  



Сейчас читают про: