2015-04-23
790
٭ Количественное определение малонового диальдегида
Свободными радикалами (R*) называют атомы, молекулы или структурные фрагменты молекул, имеющие на внешних орбиталях неспаренные электроны. В силу исключительно высокой реакционной способности радикалы могут взаимодействовать с различными молекулами, вызывая их повреждение. Малоновыйдиальдегид (МДА)― конечный продукт свободно-радикального окисленияполиненасыщенных высших жирных кислот, входящих в состав фосфолипидов биологических мембран. МДА - химически очень активное вещество: его альдегидные группы взаимодействуют с NH2-группами белков, вызывая необратимую денатурацию последних.
Активация в клетке пероксидных и свободно-радикальных процессов ― это один из факторов патогенеза атеросклероза, ишемической болезни сердца, инфаркта, инсульта, язвенной и ожоговой болезни, онкологических, воспалительных и инфекционных заболеваний, синдрома адаптационного перенапряжения и хронической усталости, диабета. Синдром пероксидации проявляется так же при низком уровне антиоксидантов, стрессе любого происхождения, действии синтетических лекарств и ксенобиотиков, гиподинамии, старении организма, избыточном потреблении в пищу жиров и углеводов, гипоксических состояниях, воздействия вибрации, электромагнитных полей, радиоактивного и ультрафиолетового излучений.
|
|
|
Цель работы. Определить содержание МДА в сыворотке крови.
Принцип метода. МДА реагирует с тиобарбитуратовой кислотой, при этом образуется окрашенное соединение – триметиловый комплекс. Оптическую плотность окрашенного раствора определяют на ФЭК при 532 нм и рассчитывают концентрацию МДА, исходя из молярного коэффициента экстинциитриметилового комплекса.
Ход определения. Студентам выдается готовый лизат, приготовленный следующим образом: к 2 мл крови добавляют 0,2 мл 0,1%-ного раствора Тритон Х-100 и оставляют на 30 мин при 0°С. МДА определяют в образовавшемся лизате по нижеприведенной схеме:
| № | Реактивы и этапы | Пробы | |
| Опыт | Контроль | ||
| Лизат, мл | 0,5 | ― | |
| Физиологический раствор, мл | 1,5 | ||
| Трихлоруксусная кислота (30%-ный раствор), мл | |||
| Инкубируют 15 мин при 0°С | |||
| Центрифугируют 10 мин при 3000 об/мин | |||
| Надосадочную жидкость аккуратно сливают в помеченные стеклянные пробирки, отбирают из них точно по 2 мл надосадочнойжидкости и добавляют: | |||
| Тиобарбитуратовая кислота (0,5%-ный раствор), мл | |||
| Кипятят 15 мин (осторожно!) | |||
| Охлаждают до 15-25°С | |||
| Фотометрируют против воды (λ=532 нм, толщина кюветы 1 см). D532 | |||
| Dоп―Dк |
Расчеты
|
|
|
Концентрацию МДА (Сх) вычисляют по формуле:
Cx=76,92•(Dоп―Dк) (мкмоль/л)
Примечание. Величина 76,92 рассчитывается исходя из молярного коэффициента экстинкции триметилового комплекса (1,56·105 М-1см-1) и разведения.
