Твёрдофазный иммуноферментный анализ

По своему принципу твёрдофазный иммуноферментный анализ ЕLISА (E nzyme- L inked I mmunosorbent A ssay) напоминает вестерн-блотинг, содержание белка-мишени в белковом экстракте определяют с помощью специфических АТ. В ЕLISА используется твёрдая полимерная матрица (96 луночный полистироловый планшет), на которой предварительно иммобилизуются АТ против белка-мишени. Иммобилизация АТ на матрице осуществляется либо путём их ковалентной «пришивки», либо путём их физической адсорбции на твёрдом носителе в результате электростатического и ван-дер-ваальсового взаимодействия.

Конкурентный иммуноферментный анализ. АТ связывают со стенками лунки на полистироловом планшете. Исследуемый материал (например, сыворотка, смыв, белковый экстракт) из исследуемого материала, содержащий искомый белок (антиген, Аг) в неизвестной концентрации, смешивают с определенным количеством меченого белка-мишени и вносят в лунки полистиролового планшета. Аг в белковом экстракте и меченный Аг конкурентно связываются с АТ, фиксированными на стенке лунок. После этого меченный Аг выявляют иммунопероксидазным методом и с помощью специального спектрального прибора определяют активность пероксидазы хрена, которая будет обратно пропорциональна концентрации Аг в исследуемом материале.

Неконкурентный иммуноферментный анализ (метод сэндвича). Первые АТ против белка-мишени иммобилизируют на стенках лунок полистиролового планшета. Затем добавляют исследуемый материал и через определённое время вносят вторые меченные АТ против белка-мишени. Вторые АТ выявляют иммунопероксидазным методом и определяют активность фермента, которая будет линейно зависеть от количества искомого белка в данном образце.