Определение активности липоксигеназы

Фермент липоксигеназа катализирует реакцию:

Ненасыщенная жирная кислота + О₂ ® гидропероксид ненасышенной жирной

кислоты

Полагают, что действию фермента подвергаются лишь те полинасыщенные жирные кислоты, которые содержат цис-цис-1,4-пентадиеновую группу, как показано ниже:

При промежуточном образовании радикалов возникает пероксид; одна двойная связь перемещается в соседнее (коньюгированное) положение, и ненасыщенная жирная кислота переходит в цис-транс-изомер:

Линолевая, линоленовая и арахидоновая кислоты окисляются ферментом с одинаковой скоростью. Жирные кислоты с транс-конфигурацией двойных связей ферментом не окисляются.

Липоксигеназа широко распространена в растительном мире. Она найдена в пшенице, семенах масличных культур, бобовых, люцерне; особенно велико ее содержание в соевой муке. В результате действия этого фермента происходит прогоркание пищевых продуктов.

Конкурентными ингибиторами фермента являются транс-линолевая и 10, 12-октадекандиеновая кислоты, также (хотя и менее эффективными) ненасыщенные и мононенасыщенные жирные кислоты.

При переработке пищевых продуктов особенно важны ингибиторы липоксигеназы, которые взаимодействуют со свободными радикалами, образующимися в качестве промежуточных продуктов, при действии этого фермента на ненасыщенные жирные кислоты, обрывают цепь превращений благодаря этому прекращают процесс окисления. Таким ингибитором является широко используемый в качестве антиоксиданта токоферол – витамин Е. Фермент можно инактивировать также термической обработкой продукта.

Препараты липоксигеназы находят ограниченное применение при выпечке белого хлеба. Во время замеса теста фермент выполняет различные функции, в результате чего улучшается цвет мякиша и увеличивается объем хлеба.

Активность липоксигеназы определяют с помощью полярографического или монометрического метода по измерению поглощения кислорода.

Принцип метода основан на измерении поглощения кислорода реакционной смесью. Максимум действия липоксигеназы злаков находится при рН 7, а липоксигеназы сои – при рН 9.

Техника определения: отвешивают 2-3 г материала и растирают с фосфатным буфером (рН 6,8) в соотношении 1:5 или 1:10. Затем в основную часть сосуда Варбурга (рис. 6) приливают 2 см³ опытной пробы (гомогената), а в боковую его часть наливают 1 см³ суспензии натриевой соли линолевой кислоты, которую готовят перед употреблением. Для этого энергично встряхивают 0,20 см³ линоленовой кислоты с 5,8 см³ 0,1 н. раствора КОН, 20 см³ фосфатного буфера с рН 6,3 и 34 см³ Н₂О.

В 1 см³ такового субстрата содержится 3,3 мг линоленовой кислоты рН 7. Далее в центральную часть прибора приливают 0,3 см³ 20 %-го раствора КОН для улавливания углекислоты. Объем жидкости в основном сосудике доводят водой до 5 см³. После этого сосуды соединяют с манометром и выдерживают на водяной бане аппарата 20 мин, до выравнивания температуры. Закрыв, верхние краны манометров и наклонив их, переливают в основную часть сосуда и затем включают качание на определенный срок. Одновременно устанавливают контрольные приборчики с манометрами, причем вместо субстрата в боковую часть сосуда наливают 1 см³ воды; в остальном поступают, так же, как и с опытным.

Показания манометров снимают через определенное число минут (5-10). Активность фермента выражают в кубических сантиметрах поглощенного кислорода на 100 мг белка или на 1 г сухой массы за условный промежуток времени.

Для вычисления объема газа, выделившегося при реакции, надо знать константу К каждого сосуда. Точную вместимость сосудов узнают по массе объема ртути (или воды), пошедшей на заполнение сосудов, и по объему манометра до нулевой точки. Зная объем 1 г ртути при определенной температуре, вычисляют исходящую вместимость сосуда. Константу К сосудов вычисляют по формуле:

,

где V₁ – общая исходная вместимость реакционного сосуда и капиллярной трубки до нулевой точки, см³;

V₂ – объем взятой жидкости в сосудик, см³;

Т – температура термостатной бани (если температура отрегулирована на 25 ⁰С, то Т= 273 + 25 = 298;

а – растворимость газов (см³) в 1 см³ воды (растворимость кислорода) при 25⁰С равна 0,028, углекислоты – 0,759;

Р₀ – давление, равное 10000 мм столба жидкости Броди.

Материалы, реактивы и оборудование: линолевая кислота (удобно получить из подсолнечного масла) или масло; 20 %-й раствор КОН; фосфатный буфер с рН 6,8; аппарат Варбурга.