Основные требования к процессу проведения электрофореза

Электрофоретическая камера. В отделах камеры буферный раствор должен иметь одинаковый уровень. Концы полосок носителя (ацетатцеллюлозной пленки) не следует погружать в буферный раствор, в котором находятся электроды. Полоска носителя должна быть хорошо натянута и расположена горизонтально. В камере должна поддерживаться определенная влажность воздуха во избежание испарения буферного раствора в середине полосы и с краев ленты. Иначе в процессе электрофоретического разделения изменяются формы пятен фракций белков.

Подготовка к электрофорезу и процедура его проведения. Перед электрофорезом камеру устанавливают строго горизонтально. Кюветы заполняют буферным раствором так, чтобы уровень жидкости в них был одинаков. Полоски ацетатцеллюлозной пленки равномерно натягивают между кюветными отделениями. Сыворотку наносят на заранее отмеченные у катода участки полосы носителя.

Нанесение на полоску носителя биологического материала осуществляется с помощью аппликатора или микропипетки. Наносят 10 мкл (0,01 мл) свежеполученной (негемолизированной) сыворотки. Крышку камеры плотно закрывают и включают прибор.

Электрофоретическое разделение белков сыворотки крови осуществляют при комнатной температуре. Оптимальное время электрофореза составляет обычно 20-40 мин (при электрофорезе на ацетатцеллюлозной пленке). По окончании электрофореза отключают источник постоянного тока, из камеры извлекают полоски ацетатцеллюлозной пленки, их не высушивают и далее обрабатывают влажными.

Для окраски электрофореграмм увлажненные буферным раствором ацетатцеллюлозные пленки кладут в развернутом виде на дно плоских эмалированных кювет и осторожно, медленно приливают красящий раствор. В процессе обработки реагентами электрофореграммы нельзя накладывать друг на друга и сворачивать.

Реактивы:

1. Буферные растворы. На электрофоретическое фракционирование белков большое влияние оказывает pH буферных растворов, состав и концентрация составляющих их реагентов, так как от кислотности (щелочности) среды буферной смеси зависит знак и величина электрического заряда молекул белков, а значит направление и скорость их движения. В качестве электролита чаще всего применяю веронал-мединаловый, веронал-ацетатный буфер с pH 8,6.

2. Окрашивающие реагенты. Основным их компонентом являются индикаторы (бромфеноловый синий, кислотный сине-черный амидо черный 10В), представляющие собой красители, характерно связывающиеся с белком. Красители используют для выявления белковых фракций. Полоски в этих красителях выдерживают в течение 30 минут.

3. Отмывающие растворы. Для удаления не связавшегося с белком красителя электрофореграммы обрабатывает в нескольких (обычно 3-5) сменах отмывающего раствора до тех пор, пока фон лент не сделается светлым (белым), а промывная жидкость не перестанет окрашиваться в желтый цвет.

Состав отмывающего раствора во многом зависит от природы применявшегося для окрашивания белков индикатора. При окраске бромфеноловым синим используют раствор уксусной кислоты, получаемый добавлением к 20 мл ледяной уксусной кислоты 980 мл дистиллированной (или водопроводной) воды. Ленты, отмытые от избытка красителя, высушивают на воздухе при комнатой температуре (если в качестве индикатора использовался бромфеноловый синий, то в затемненном помещении).

Сухие окрашенные электрофореграммы хранят в темноте.