Выделение плазмидной ДНК из дрожжей на колонках

Быстрый метод выделения плазмидной ДНК из дрожжей на колонках для последующей трансформации E.coli или проведения PCR.

Растворы.

· Tris/Сорбитол

· I плазмидный раствор

· II плазмидный раствор

Комментарии.

· Общие.

· По пунктам.

1. Посеять одиночную колонию в 3ml селективной среды и растить не менее 20h при +30°С;

2. 1.5ml ночной культуры поместить в 1.7ml пробирку, ЦФ 3', удалить супер;

3. Суспендировать осадок в 300µl раствора "Tris/Сорбитол";

4. Добавить 5 µl литиказы (10u/µl);

5. 37°С, 1h, время от времени перемешивать;

6. ЦФ 3', удалить супер;

7. Суспендировать осадок в 50µl "I" плазмидного раствора;

8. + 100µl "II" плазмидного раствора, ~3 раза перевернуть;

9. 0oС, 5';

10. + 50µl холодного 10М AcONH4, ~3 раза перевернуть;

11. 0oС, 5';

12. ЦФ 10', супер перенести в новую пробирку;

13. К суперу добавить 800µl "Capture buffer"

14. Поместить колонку в 2ml пробирку;

15. Нанести на колонку 500µl из п.13, ЦФ 1';

16. Нанести на колонку оставшиеся 500µl из п.13, ЦФ 1';

17. Нанести на колонку 500µl "Wash buffer", ЦФ 1';

18. Поместить колонку в чистую 1.5ml пробирку;

19. Нанести на колонку 20-50µl 10mM Tris-HCl pH=8.0, инкубировать 2';

20. ЦФ 20'', элюат перенести в новую пробирку.