Методика. 1. Одну бактериальную колонию (полученную в результате эксперимента по трансформации, как это описано в протоколе 13.1

1. Одну бактериальную колонию (полученную в результате эксперимента по трансформации, как это описано в протоколе 13.1, или ранее расштрихованную из хранящейся в глицерине бактериальной культуры) вносят в неплотно закрытую пробирку на 15 мл с 2 мл LB-среды, содержащей соответствующий антибиотик. Растят бактериальную культуру при интенсивном встряхивании (200 об/мин) при 37 С в течение ночи до ОД600=1Д

2. Переносят 1,5 мл культуры в микроцентрифужную пробирку и собирают клетки центрифугированием при 12 000 g в течение 1 мин. Оставшуюся культуру хранят при 4 С.

3. Отсасывают супернатант и при интенсивном встряхивании ресуспендируют осадок бактериальных клеток в 100 мкл холодного раствора I. Инкубируют во льду 15 мин.

4. Добавляют 200 мкл раствора II и перемешивают смесь быстрым пятикратным переворачиванием закрытой пробирки без встряхивания. Инкубируют пробирку во льду 5 мин.

5. Добавляют 150 мкл буфера 111, закрывают пробирку и перемешивают содержимое осторожным встряхиванием в течение 10 с. Инкубируют во льду 10 мин.

6. Центрифугируют на микроцентрифуге при 12 000 g в течение 5 мин при 4 С и отбирают супернатант в новую пробирку.

7. Для осаждения двухцепочечной ДНК добавляют 1 мл холодного этанола, перемешивают встряхиванием и на 30 мин помещают на —20 С.

8. Центрифугируют на микроцентрифуге при 12 000 g в течение 5 мин при 4 С.

9. Осторожно отбирают супернатант и ресуспендируют осадок в 100 мкл раствора IV.

10. Добавляют 200 мкл этанола, перемешивают и на 10 мин помещают на —20 °С. Центрифугируют на микроцентрифуге при 12 000 g в течение 2 мин при 4 °С.

11. Отбирают супернатант, добавляют к осадку 1 мл этанола, центрифугируют на микроцентрифуге при 12 000 g в течение 2 мин при 4°С.

12. Отбирают супернатант, осадок нуклеиновых кислот подсушивают на воздухе в течение 10 мин. Растворяют нуклеиновые кислоты в 50 мкл ТЭ и хранят при -20 С.

Обычно метод, описанный в протоколе, дает при выделении многокопийных плазмид типа pUC выход 3-5 мкг ДНК на 1 мл исходной бактериальной культуры. Если полученные таким способом мини-препараты ДНК не удается рестрицировать, то для удаления загрязнений можно провести экстракцию фенолом/хлороформом. Пропорционально увеличив количество всех необходимых реактивов, можно использовать данный метод для выделения ДНК из культур объемом до 10 мл.


Понравилась статья? Добавь ее в закладку (CTRL+D) и не забудь поделиться с друзьями:  



double arrow
Сейчас читают про: