Комментарии

Общие.

· Плазмидная ДНК, выделенная этим методом, не имеет особого загрязнения геномной ДНК и РНК, но концентрация ее очень мала. Тем не менее, ее вполне достаточно для химической трансформации E.coli. Если трансформировать 5µl выделенной плазмиды, то вырастает обычно около сотни колоний.

· Плазмида также годится для проведения PCR.

По пунктам.

п. 1.

· Мы обычно растим дрожжи в SD среде с необходимым набором аминокислот. Если необходимо, с добавлением антибиотиков. В богатой среде YPD можно растить только те плазмиды, которые достаточно стабильны и не теряются в процессе роста дрожжей.

п. 4.

· Литиказа (Sigma, #L4025) разрушает клеточную стенку дрожжей.

п. 13.

· Мы используем стекловолоконные колонки фирмы Amersham (GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit, #27-9602-01). Можно также использовать кит фирмы Qiagen или любой аналогичный.

п. 14.

· Пробирка берется такая, что бы уровень жидкости после центрифугирования в пунктах 15, 16,17 не касался нижнего края колонки. Можно использовать 2ml пробирки с завинчивающейся крышкой или пробирки из кита.

п. 15,16,17.

· После каждого пункта, удалять жидкость, прошедшую через колонку.

п. 20.

· Элюат - это то, что сошло с колонки.