Очистка плазмидной ДНК при центрифугировании. Выделение плазмидной ДНК из бактериальной культуры

В присутствии бромистого этидия различие в плавучей плотности плазмидной и хромосомной ДНК становится еще более значительным. Связываясь с линейной двухцепочечной ДНК, этот краситель встраивается между плоскостями оснований (интеркалирует), вызывает расплетание двойной спирали, увеличивает длину линейных фрагментов хромосомной ДНК и приводит к снижению ее плавучей плотности. В плазмидной ССС-ДНК интеркаляция красителя вызывает образование компенсаторных сверхспиральных витков, и при достаточно большом их числе встраивание следующих молекул бромистого этидия становится невозможным.

При равновесном центрифугировании в градиенте насыщенного раствора хлористого цезия в присутствии бромистого этидия плазмидная ДНК имеет более высокую плавучую плотность, чем хромосомная, и концентрируется в полосе, расположенной ниже, чем полоса хромосомной ДНК. Обычно эта полоса имеет красный цвет и ее не нужно визуализировать в УФ-свете. РНК при центрифугировании осаждается на дне пробирки.

Чтобы отобрать плазмидную ДНК после центрифугирования, пробирку прокалывают сбоку на нужной высоте иглой, надетой на шприц, и отсасывают материал. Обычно препарат плазмидной ДНК после центрифугирования в равновесном градиенте плотности в присутствии красителя содержит очень мало РНК и белков и они не влияют на последующие манипуляции с плазмидной ДНК. При необходимости примеси белков можно удалить экстракцией фенолом/хлороформом, а примеси РНК — центрифугированием или хроматографией. Если провести ультрацентрифугирование не удается, то процедуру вьщеления из больших объемов культуры можно довести до п. 8, а потом до переосаждения этанолом удалить белковые примеси, как это описано в протоколе.

Выделение плазмидной ДНК из небольшого объема бактериальной культуры

Материалы

• Раствор I: 50 мМ глюкоза, 25 мМ трис-HCl, рН 8,0, 10 мМ ЭДТА. Хранить при 4 °С

• Раствор II: 0,2 М NaOH, 1,0% (о/о) ДСН. Раствор можно хранить при комнатной температуре не более недели.

• Раствор III: 60 мл 5 М ацетата аммония, 11,5 мл ледяной уксусной кислоты, 28,5 мл Н20. Полученный в результате раствор является 3 М по ионам аммония и 5 М по ацетат-ионам.

• Раствор IV: 100 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 10 мМ трис-HCl, рН 7,5.