Лабораторная работа «Ферменты»

Цели и задачи: изучить вопросы организации ферментов, механизм их действия, влияние рН и температуры среды на активность ферментов; изучить методы определения активности ферментов, влияние активаторов и ингибиторов на их активность, определить экспериментально активность
α-амилазы слюны.

Студент должен:

- знать: строение ферментов, современные представления о механизме действия ферментов, классификацию ферментов, их основные свойства; определение активности ферментов, единицы ее измерения, механизм влияния активаторов и ингибиторов на активность фермента; использование определения активности ферментов в клинической диагностике;

- уметь: обнаруживать ферменты в биологических объектах, проводить химический эксперимент по изучению влияния рН и температуры на активность фермента; проводить эксперимент по изучению влияния активаторов и ингибиторов на активность ферментов; осуществлять определение активности ферментов методом разбавления;

- владеть: техникой проведения лабораторных работ, методикой сбора и анализа данных эксперимента.

Ферменты - вещества в основном белковой природы, обладающие каталитической активностью.Ферменты ускоряют протекающие в организме реакции вследствие снижения энергетического барьера реагирующих веществ. Главное отличие ферментов от катализаторов небиологической природы состоит в исключительно высокой каталитической активности и ярко выраженной специфичности действия.

Активный центр фермента - уникальная комбинация аминокислотных остатков, которая обеспечивает непосредственное связывание активного центра с молекулой субстрата и прямое участие в акте катализа.

Существуют простые ферменты: пепсин, трипсин и др. Большинство природных ферментов относится к классу сложных белков. Небелковые компоненты – кофакторы - могут иметь различную химическую природу и различаться по прочности связи с полипептидной цепью.

Классификация ферментов основана на типе катализируемой химической реакции. В соответствии с этим все ферменты делятся на 6 классов:

1. Оксидоредуктазы.

2. Трансферазы.

3. Гидролазы.

4. Лиазы.

5. Изомеразы.

6. Лигазы.

Температура, соответствующая максимальной скорости ферментативной реакции, называется оптимальной (Т_opt). Для большинства ферментов организма человека она равна 37-40 °С. При снижении температуры скорость ферментативного катализа падает, достигая при 0 °С минимальной величины. Ферменты термолабильны, т.е. чувствительны к высокой температуре. Большинство ферментов разрушается при нагревании их до 60-70 °С в течение часа, до 80-100 °С - в течение нескольких минут вследствие денатурации.

Для каждого фермента имеется определенное значение рН среды, при котором он является наиболее активным (оптимум рН). При увеличении или понижении кислотности среды активность ферментов снижается. Ферменты, как и другие белки, содержат в своем составе аминокислоты с ионогенными группами в радикалах, степень диссоциации которых зависит от рН. Изменение степени диссоциации этих групп влияет на конформацию фермента и его каталитические свойства.

Факторами, определяющими активность ферментов, являются концентрации субстрата и фермента; присутствие активаторов и ингибиторов.

Химические соединения, увеличивающие скорость ферментативной реакции, называются активаторами. Часто активаторами ферментов являются Mg²⁺, Mn²⁺, Zn²⁺, K⁺ и Со²⁺.

Ингибиторы тормозят действие ферментов. Любые агенты, вызывающие денатурацию белка, приводят к необратимой инактивации фермента. Специфические ингибиторы действуют на какой-либо один фермент или группу ферментов.

Обратимое ингибирование действия ферментов может быть конкурентным и неконкурентным. Конкурентное ингибирование основано на связывании активным центром веществ, имеющих структуру, похожую на структуру субстрата. Степень ингибирования в данном случае зависит от соотношения концентрации субстрата и ингибитора. Метод конкурентного торможения широко применяется в медицинской практике (сульфаниламидные препараты).

При неконкурентном ингибировании субстрат и ингибитор связываются с разными центрами. Это приводит к изменению конформации активного центра и снижению активности фермента.

О скорости ферментативной реакции судят или по скорости убыли субстрата, или по скорости образования продукта реакции. При оптимальных условиях скорость катализируемой реакции пропорциональна концентрации фермента.

Для оценки активности фермента используют стандартные международные единицы (Е или U). За единицу активности 1 U(Е) фермента принимается то количество его, которое в оптимальных условиях катализирует превращение 1 микромоль субстрата или образование 1 микромоль продукта в минуту (мкмоль/мин).

В Международной системе единиц (СИ) активность фермента выражается в каталах (кат, kat):
1 кат есть каталитическая активность, способная осуществлять реакцию со скоростью, равной 1 моль/с.

1 U(Е) фермента соответствует 16,67 нкат.

Удельную активность фермента принято выражать числом единиц ферментативной активности на 1 мг белка (или числом каталов на 1 кг активного белка).

Большинство ферментов локализовано в тканях и органах, и их активность в сыворотке крови незначительна. Патологические процессы, связанные с нарушением целостности клеток, способствуют выходу ферментов в кровь. Увеличение активности ферментов сыворотки крови является диагностическим тестом, свидетельствующим о патологии определенных органов и тканей. Количественное определение активности ферментов используется в клинике с целью постановки диагноза, наблюдения за эффективностью лечения и прогноза.

Реактивы, оборудование: слюна, 0,5% раствор крахмала, 1%-ный раствор хлорида натрия, 1% раствор сульфата меди, раствор Люголя, 0,1% раствор крахмала, 2 н раствор соляной кислоты, 10% раствор серной кислоты, крахмальный клейстер, дистиллированная вода, пробирки, стаканы, термометр, баня водяная, электрическая плитка, пипетки, стеклянные палочки, спиртовка, пробиркодержатели.

1. Гидролиз крахмала α-амилазой слюны

Рот ополаскивают 2-3 раза водой для удаления остатков пищи. Отмеряют 50 мл дистиллированной воды и ополаскивают ею рот в течение 3-5 мин в несколько приемов. Полученную жидкость собирают в химический стакан.

Готовят 2 водяные бани с температурой 37-40 и 100 °С. В пробирки наливают растворы в соответствии с таблицей. Помещают пронумерованные пробирки в бани. По ходу эксперимента (10–15 мин) проводят пробы с раствором Люголя, для чего через каждые 2 минуты наносят на стеклянную пластинку стеклянной палочкой каплю раствора Люголя, а затем чистой палочкой - каплю раствора из пробирки. Отмечают окрашивание, возникшее при смешивании двух капель. Результаты опыта и заключения о протекании гидролиза (полный, частичный, не протекает) заносят таблицу:

Схема гидролиза крахмала α-амилазой слюны:

(С₆Н₁₀О₅)_n крахмал		(С₆Н₁₀О₅)_m амилодекстрины
(С₆Н₁₀О₅)_k эритродекстрины		(С₆Н₁₀О₅)_l ахродекстрины
(С₆Н₁₀О₅)_x мальтодекстрины		С₁₂Н₂₂О₂₂ мальтоза

В выводах сравните активность неорганического катализатора и фермента; сделайте заключение о влиянии рН и температуры на активность амилазы.

№	Содержимое пробирки	Т, °С	Время, мин.	Цвет в реакции с йодом	Наличие гидролиза
	3 мл р-ра крахмала + + 2 мл 10% H₂SO₄
	3 мл р-ра крахмала + + 2 мл 10% H₂SO₄
	3 мл р-ра крахмала + + 3 мл р-ра амилазы
	3 мл р-ра крахмала + 3 мл р-ра амилазы + + 1 мл 2 н НС1
	3 мл р-ра крахмала + + 3 мл прокипяченного р-ра амилазы

2. Действие активаторов и ингибиторов на α-амилазу слюны.

В первую пробирку наливают 1 мл 1% раствора хлорида натрия, во вторую - 1 мл 1% раствора сульфата меди, в третью - 1 мл дистиллированной воды. Во все пробирки добавляют по 2 мл 0,5% раствора крахмала и по 2 капли разведенной водой слюны (1:5). Содержимое пробирок перемешивают встряхиванием, помещают в водяной термостат с температурой 37 °С. Через интервалы в 1 минуту из пробирок отбирают пробы в чистые пробирки (0,3-0,5 мл) и проводят с ними реакцию с раствором Люголя. Результаты (цвет раствора) записывают в таблицу. Гидролиз проводят в течение 5 минут. Делают вывод о действии (активатор, ингибитор) исследованных добавок.

№ пробирки
Добавка	NaCl	CuSO₄	H₂O
Время, мин

3. Определение активности α-амилазы слюны по Вольгемуту.

Метод основан на установлении предельного разведения раствора α-амилазы, при котором еще происходит в определенных условиях расщепление заданного количества крахмала до эритродекстрина. Методом Вольгемута можно пользоваться для определения α-амилазы в панкреатическом соке, крови, моче и других биологических жидкостях. Но данный метод дает лишь приблизительные результаты.

Собирают слюну. 1 мл слюны помещают в пробирку, добавляют 9 мл дистиллированной воды и перемешивают. Получается раствор слюны 1:10.

В 10 пронумерованных пробирок наливают по 1 мл воды. В первую пробирку вносят 1 мл раствора слюны и перемешивают путем трехкратного втягивания и выпускания жидкости из пипетки. Затем 1 мл жидкости из первой пробирки переносят во вторую пробирку, перемешивая содержимое, как указано выше. 1 мл жидкости из второй пробирки переносят в третью и т. д. Из десятой пробирки после перемешивания 1 мл жидкости удаляют.

Во все пробирки, начиная с десятой, добавляют по 2 мл 0,1% раствора крахмала, содержимое перемешивают. Пробирки помещают в термостат при 37 °С на 30 минут.

Через 30 минут пробирки охлаждают под краном и добавляют в каждую по 1 капле раствора Люголя. Полученные данные заносят в таблицу. Отмечают пробирку с наибольшим разведением слюны, при котором произошло расщепление крахмала до эритродекстрина, дающего с йодом красно-бурое окрашивание.

Активность α-амилазы выражают количеством миллилитров 0,1% раствора крахмала, которое может расщепить 1 мл неразведенной слюны при 37 °С в течение 30 минут до стадии эритродекстрина.

Пример: если красно-бурая окраска отмечена в четвертой пробирке, где слюна разбавлена в
160 раз. 1 мл неразбавленной слюны расщепил бы в 160 раз больше раствора крахмала за 30 минут при 37 °С: 2 мл×160 = 320 мл 0,1% раствора крахмала. Условно это принимают за 320 единиц α-амилазы по Вольгемуту:

А 37°/30' = 320 ед.