2015-05-12
265
1. В соответствии с приведенной ниже таблицей готовят три пробирки: пробирку №1 – контрольная проба; пробирку №2 – инкубируемая проба и пробирку №3 – инкубируемая проба, содержащую высокую концентрацию АМР.
| Отмерить (мл) | №1 | №2 | №3 |
| 0,02 М раствор глюкозы | 0,5 | 0,5 | 0,5 |
| 0,06 М раствор АТР | 0,5 | 0,5 | – |
| 0,6 М раствор АТР | – | – | 0,5 |
| ФСБС | 0,5 | 0,5 | 0,5 |
2. Все пробирки помещают на 5 мин в лед.
3. Во все пробирки (не вынимая их изо льда) добавляют по 1,5 мл мышечного экстракта и тщательно перемешивают.
4. Пробу №1 оставляют на льду, а пробы №2 и 3 инкубируют в течение 30 мин при 26° С в водяной бане.
5. После инкубации пробы №2 и 3 помешают на лед.
6. Далее во всех пробах определяют содержание глюкозы и молочной кислоты, для этого с пробами поступают следующим образом:
· из пробы №1 сразу же после добавления экстракта отбирают 0,5 мл инкубационной смеси и переносят в пробирку, содержащую 2,5 мл H2O, 2 мл 5% раствора ZnSO4×7H2O и 1 мл 0.3М NaOH, и перемешивают;
· к оставшейся в пробе №1 инкубационной смеси приливают равный объем 5% раствора ТХУ;
· из проб №2 и 3 отбирают 1 мл инкубационной смеси и переносят в пробирку, содержащую 2 мл H2O, 2 мл 5% раствора ZnSO4×7H2O и 1 мл 0,3 М NaOH, и перемешивают;
· к оставшимся в пробах №2 и 3 инкубационным смесям приливают равные объемы 5% раствора ТХУ;
· образующиеся осадки белков во всех пробах (и осажденных цинковой смесью, и осажденных ТХУ) удаляют центрифугированием при 3 000 об/мин в течение 10 мин;
· концентрацию глюкозы в супернатантах проб, осажденных цинковой смесью, определяют энзиматическим методом с глюкозооксидазой (методика описана ниже).
· концентрацию молочной кислоты в супернатантах проб, осажденных ТХУ, определяют по реакции с п -оксидифенилом (методика описана ниже).
7. Об интенсивности гликолиза судят по убыли глюкозы и по приросту молочной кислоты.
8. Делают выводы о влиянии АМР на скорость гликолиза.
