Тема: обмен углеводов

Получение препарата мышечного экстракта
для изучения гликолиза

Приготовление мышечного гомогената

1. Мышечную ткань крысы по возможности тщательно освобождают от связок, жира и измельчают ножницами.

2. Взвешивают 10 г измельченной ткани и помещают в охлажденный стакан гомогенизатора, содержащий пятикратный объем среды гомогенизации. В качестве среды гомогенизации применяют 0,9%-ый раствор NaCl. В среду гомогенизации рекомендуется добавить никотинамид в конечной концентрации 4×10^‑2 М для ингибирования нуклеозидазы, расщепляющей NAD⁺.

3. Гомогенизацию проводят в гомогенизаторе со стеклянным или тефлоновым пестиком в течение 10 мин.

4. Гомогенат переливают в мерный цилиндр и средой гомогенизации доводят объем до метки так, чтобы в 1 мл гомогената содержалось 200 мг размельченной мышечной ткани (разведение 1:5).

Получение мышечного экстракта

1. Мышечный гомогенат подвергают центрифугированию при 3 000 об/мин в течение 10 мин для удаления дебриса – остатков разрушенных клеток и ядер. В надосадочной жидкости – экстракте – содержатся цитоплазматические ферменты гликолиза, митохондрии и микросомы.

2. Для удаления митохондрий экстракт дополнительно центрифугируют в течение 10 мин при 11 000 об/мин.

3. Полученный супернатант фильтруют через 4 слоя марли.

4. Значение рН в полученном экстракте доводят до 7,4.

Гликолиз и его регуляция

Для изучения интенсивности протекания гликолиза в полученном препарате мышечного экстракта, последний инкубируют в среде, содержащей глюкозу, АТР, а также соединения-регуляторы (АТР, ADP или лимонную кислоту) гликолитического пути распада глюкозы. За изменением содержания глюкозы в анализируемых пробах следят с помощью глюкозооксидазного (энзиматического) метода, а накопление молочной кислоты (конечного продукта гликолиза в анаэробных условиях) определяют по реакции с п -оксидифенилом.