Эксцизионная репарация нуклеотидов у эукариот

Эукариоты, включая дрожжи и человека, не имеют прямых гомологов системы UvrABC, но сам механизм NER у них чрезвычайно сходен с таковым у прокариот.

Системой NER у эукариот удаляются крупные ДНК-аддукты, такие как 4-6-фотопродукты, пиримидиновые димеры, индуцированные УФ-светом и другие повреждения, возникающие под действием различных генотоксических агентов, например, бензопирена или афлатоксина. В нее вовлечено не менее 30 белков. Белки, участвующие в этом процессе были изолированы из почкующихся дрожжей Saccaromyces cerevisiae, из делящихся дрожжей Shiyzosaccaramyces pombe и из клеток млекопитающих (преимущественно грызунов и человека). Главное открытие, связанное с этим - высокое структурное и функциональное постоянство этих генов у столь разных организмов, которое можно распространить на всех эукариот. Вывод о том, что механизм NER сходен, если не идентичен у всех видов эукариот, означает, что данные полученные на одних организмах, можно смело приложить к другим. Дефекты NER у человека приводят к появлению различных наследственных синдромов (XP, CS, TTD, UVSS), о которых мы поговорим ниже.

Прежде чем углубляться в подробности, неизбежно придется остановиться на вопросах номенклатуры. Хорошо известен тот печальный и неизбежный опыт, что мутанты и соответствующие им гены приходится обозначать до того, как становятся понятны их структура и функции, к тому же в разных областях при использовании различных экспериментальных моделей складываются свои системы номенклатуры. Это часто приводит к путанице, и гены репарации ДНК не являются в этом смысле исключением. У дрожжей соответствующие гены обозначаются и у S.serevisise и у S.pombe как Rad и rad (от radiation), но их порядковые номера не совпадают. (Например, ген Rad3 S.sereviseae и ген rad3 S.pombe - совершенно разные, а гомологом гена Rad3 является ген rad15). У млекопитающих обозначение репарационных мутантов и генов имеют разное происхождение. В экспериментах на клетках грызунов были выделены мутанты, относящиеся к 11 группам комплементации и имеющие различные дефекты ЭР, а человеческие гены, комплементирующие эти мутанты обозначили ERCC (Exision Repair Cross Complementing) 1-11. У человека же соответствующие мутанты были получены от больных с различными наследственными нарушениями репарации - пигментной ксеродермой (XP), синдромом Коккейна (CS) и трихотиодистрофиeй (TTD). Различные группы комплементацтии этих штаммов были обозначены в соответствии с источником их получения: XP-A (B,C,D,E,F,G), CS-A, CS-B, TTD-A, а их гены - XPA, XPB и т.д. Когда все эти гены были клони­рованы и анализированы, стало оче­видно, что некоторые ERCC, XP, CS и TTD гены идентичны. Например, ERCC2 и XPD. В таких случаях было принято, что обозначение ERCC следует, когда это возможно, заменять на обозначение гена болезни. К тому же другими способами были изолированы еще некоторые гены, вовлеченные в процесс NER, соответственно с независимыми названиями. Для того, чтобы мы могли легко ориентироваться в этом многообразии, приведем табл. 4 со всеми сводными данными по названиям генов, вовлеченных в NER

Эта таблица облегчит нам дальнейшее изложение материала. Почти во всех случаях гены обоих видов дрожжей были клонированы по их способности комплементировать УФ-чувствительность соответствующих мутантов.

Гены ЕRCC были клонированы подобным же образом при использовании геномной ДНК человека для обработки мутантных клеточных линий грызунов с последующим восстановлением нормальной УФ-чувствительности и клонированием корректирующей ДНК. Клонированные ERCC гены были затем введены путем трансфекции или микроинъекций в клетки, принадлежащие больным с различными синдромами. Так было установлено соответствие между генами ERCC и генами, отвечающими за некоторые человеческие болезни. Общая схема этого процесса у эукариот представлена на рис. 12.

В действительности эта схема несколько упрощена, так как NER может осуществляться двумя путями – общей репараций генома (global genomic repair, GGR) и репарацией, спаренной с транскрипцией (transcription-coupled repair, TCR), а данная схема описывает собственно только процесс GGR, который очень хорошо изучен. Разберем этот процесс подробнее.

1(а). Распознавание повреждения. Комплексы XPC-HR23A и RPA-XPA (именно эти белки изображены на схеме) находят повреждения ДНК. XPC-HR23A высокоспецифично распознает 6-4-фотопродукты, но не пиримидиновые димеры, 8-оксигуанин или О⁶-метилгуанин. RPA-XPA напротив, узнают и 6-4PP и ДНК-сшивки. Неясно, какой из комплексов начинает процесс, мнения ученых противоречивы.

Вероятнее, что это RPA-XPA, так как ХРА может двигаться по ДНК, как бы отыскивая повреждение, пока на него не наткнется. Оба эти комплекса могут быть задействованы и в GGR, и в TCR

Другой белковый комплекс, распознающий пиримидиновые димеры, состоит из двух «белков, связывающихся с поврежденной ДНК» (damaged DNA binding protein, DDB1 (h127) и DDB2 (p48), он же XPE). Этот комплекс участвует только в GGR, но не в TCR. При этом его сродство к поврежденной ДНК крайне высоко - в 500 000 раз выше, чем к интактной, вероятно, поэтому он может первым связаться с повреждением, обнаруженным комплексом XPC-HR23A на нетранскрибируемой нити, а также привлечь к месту повреждения комплекс RPA-XPA. Очень важным наблюдением является то, что дефектные по Р53 клетки человека имеют сниженную активность GGR и нарушение репарации пиримидиновых димеров.

Рисунок 12. Схема процесса NER у эукариот.

Это связано с тем, что транскрипция генов XPC и DDB2 (XPE) зависит от Р53 и индуцируется УФ-облучением. Клетки больных синдромом Ли-Фромени (мутантные по гену р53) таким образом являются дефектными по репарации пиримидиновых димеров, так как в них отсутствует Р53-зависимая индукция DDB2. У человека ХРС индуцируется не только УФ-светом, но и алкилирующими агентами и бензопиреном. При этом у мышей нет индукции DDB2 под действием УФ-облучения. Недавно получены крайне интересные данные о том, что при дефекте Р53 ХРС и ХРЕ могут быть индуцированы оверэкспрессией BRCA1 (белок, связанный с развитием семейных форм рака молочной железы и яичников, breast cancer 1).

2 (б).Раскручивание ДНК. После распознавания повреждения к нему подходит фактор транскрипции РНК-полимеразыII - TFIIH, состоящий из 7 субъединиц (XPB, XPD, GTF2H1, GTF2H2, GTF2H3, GTF2H4, CDK7, CCNH, MNAT1). В большинстве случаев это привлечение осуществляется комплексом XPC-HR23A. TFIIH обладает геликазной активностью благодаря геликазам ХРВ и ХРD, раскручивающим ДНК около повреждения в разные стороны.

3 (в). Эксцизия повреждения ДНК. После распознавания ДНК и образования открытого комплекса, ДНК надрезается с двух сторон от повреждения. 3’-инцизия осуществляется эндонуклеазой XPG, а 5’-эндонуклеазным комплексом XPF-ERCC1.

4 (г-д). Репаративный синтез и лигирование. Образовавшаяся брешь заполняется ДНК-полимеразами δ и ε и сшивается ДНК-лигазой I при участии сопутствующих факторов.