NER, спаренная с транскрипцией: TCR (transcription coupled repair)

В начале 80-х годов Филипп Ханавалт сформулировал представление о преимущественой репарации ДНК. Это явление заключается в более быстром удалении цикдобутановых пиримидиновых димеров и некоторых других типов повреждений оснований из транскрипционно активных генов по сравнению с транскрипционно молчащими участками генома. Окончательное понятие (на сегодняшний день) преимущественной репарации таково: во многих, но не во всех, транскрипционно активных генах транскрибируемая (матричная) нить репарируется быстрее, чем нетранскрибируемая (кодирующая) нить (нить-специфическая репарация); и транскрибируемая часть генома репарируется быстрее, чем молчащая. Существование эксцзионной репарации нуклеотидов, спаренной с транскрипцией, как раз и является доказательством этой гипотезы.

У E.coli обнаружен мутант mdf (mutation frequency decline) с нарушением NER. Оказалось, что этот ген кодирует белок, названный TRCF (transcription repair cupling factor), который «убирает» комплекс РНК-полимеразы вместе с транскриптом с ДНК, если тот остановиться перед повреждением, способствуя таким образом репарации данного повреждения. То есть вся система репарации, спаренной с транскрипцией, отличается от описанного нами ранее процесса NER только одним этим фактором.

Такие белки, как фактор связывания транскрипции и репарации (transcription Repair Cupling Factor, TRCF), явно вовлеченные в объединение транскрипции и эксцизионной репарации в то же время не явля­ются белками, абсолютно необходимыми для транскрипции самой по себе.

TCR убирает различные повреждения, останавливающие продвижение РНК-полимеразы на транскрибируемой нити транскрибируемого гена. Дефект этого пути репарации приводит к Синдрому Коккейна (СS), при этом при данном заболевании вообще резко снижен уровень транскрипции и его относят к так называемым «транскрипционным синдромам», а не только к «репарационным синдромам». Именно с этим связано то, что уровень опухолеобразования у больных синдромом Коккейна не повышен, по сравнению с контролем – клеткам просто не хватает транскрипционной активности для поддержания опухолевых, активно пролиферирующих клеток. Хотя есть предположение, связывающее это явление с повышенным уровнем апоптоза. Для TCR основными необходимыми белками являются CSА, CSB, XPB, XPD (члены TFIIH) и XPG. CSB, но не CSA непосредственно связывается с РНК-полимеразой II (хотя не совсем понятно, как именно) и таким образом активирует соответствующую ветвь NER, что приводит к отсоединению остановившегося комплекса RNApolII от поврежденной ДНК. TCR и GGR могут быть объединены белком CSB, вероятно, он работает как «фактор, разделяющий транскрипцию и репарацию». CSB использует свою способность к транслокации ДНК для того, чтобы отделить комплекс RNApolII от остановленной вилки транскрипции. После обработки клеток таким агентом, как цисплатин или после УФ-облучениия наблюдается CSA и CSB-зависимая убиквитинирование RNApolII комплекса, облегчающая его перемещение и последующий протеолиз.

У дрожжей описаны дополнительный фактор Def1, взаимодействующий с Rad26 (гомолог CSB), ответственный за убиквитинирование и протеолиз RNApolII в тех случаях, когда повреждение не может быть отрепарировано. Есть ли гомолог этого фактора у человека – неясно. Для восстановления транскрипции RNApolII должна снова оказаться в гипофосфорелированной форме (только так она связывается с ДНК), количество которой резко падает после УФ-облучения. Может быть, при участии комплекса TFIIS, RNApolII комплекс не отходит от ДНК, а лишь перемещается назад на 20-35 нуклеотидов от повреждения, что позволяет ему вернуться к прерванной работе после завершения процесса репарации. Вероятно, в TCR принимают участие еще два фактора – человеческий гомолог фактора 2 (HuF2, TTF2) и АТФ-зависимфй фактор терминации RNAPII, которые также помогают убирать остановившиеся перед повреждениями РНК-полимеразы I и II. Возможно, в этот процесс вовлечен и один из белков MMR - MSH2.

Современные представления о различных системах эксцизионной репарации и их взаимосвязи могут быть хорошо отражены на рис. 13, где представлена схема, предложенная Г.Спивак, которая даже выделяет TCR в отдельный тип эксцизионной репарации нуклеотидов, а GGR считает синонимом NER.

На схеме показано, что при NER (GGR) повреждения распознаются комплексом XPC-HHR23 и, в некоторых случаях ДНК-связывающей активностью, контролируемой белком ХРЕ. Субъединицы комплекса TFIIH XPB/XPD геликазы вместе с белком ХРА и PCNA открывают ДНК вокруг повреждения. Инцизия эндонуклеазами XPG и XPF-ERCCI предшествует эксцизии олигонуклеотида, содержащего повреждение. Брешь заполняется ДНК полимеразами δ или ε, причем реакция требует присутствия RFC, PCNA и RPA. ДНК лигазаI завершает реакцию восстановления непрерывности ДНК. При BER гликозилаза, которая может быть стимулирована XPG, распознает повреждение и удаляет основание. Получившийся АР-сайт распознается АР-эндонуклеазой (АРЕ) или АР-лиазой (в некоторых случаях АРЕ и АР-лиазная активности совмещены в одном и том же белке.) Продукт действия АРЕ или АР-лиазы содержит 5’ или 3’ терминальный остаток, к которому и прилагается ДНК-полимеразная активность полимеразы β или, соответственно, еще одна АРЕ-активность.

Рисунок 13. Схематическая модель путей эксцизионной репарации ДНК у эукариот. Объяснение в тексте.

Однонуклеотидная брешь заполняется ДНК-полимеразой β, а синтез длинного участка (6-14 нуклеотидов) обычно проводят полимеразы ε/δ, PCNA, RFC и FENI. Лигаза I или комплекс лигазаIII/XRCCI завершают репарационную реакцию.

Распознавание повреждения при TCR является очень сложным, оно инициируется в момент остановки РНК-полимеразы II перед повреждением, затем TFIIH и XPG призываются в тоже место, возможно, в зависимости от природы препятствия. Дополнительные факторы, необходимые для всех типов повреждений, обозначены пятиугольниками, для массивных аддуктов – треугольниками, для поврежденных оснований – ромбами.В случае, если транскрипционный комплекс убирается или переносится, репарация протекает по пути NER, BER или другому специальному пути. Обратите внимание, что в распознавании повреждений при TCR принимают участие белки системы MMR – hMSH2, hPMS2, hMLH1.