Дарвиновская эволюция в пробирке

Хороший метод зачастую позволяет осуществить революцию в науке. Именно так можно сказать о методе полимеразной цепной реакции (ПЦР), который позволяет размножать нуклеиновые кислоты в неограниченных количествах. Кратко опишем суть метода. Для размножения ДНК в методе ПЦР используются ферменты ДНК-полимеразы, т. е. те самые ферменты, которые при размножении клеток синтезируют из активированных мономеров-нуклеотидов комплементарные цепочки ДНК.

Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР), который позволяет в неограниченном количестве „размножать“ нуклеиновые кислоты, произвёл настоящую революцию в биологии. Суть метода проста: спираль ДНК разделяют нагреванием, а затем на каждой цепи с помощью специального фермента собирают цепочку, комплементарную исходной. В результате из одной двуцепочечной ДНК получается две. Из двух — четыре и т. д. Процесс можно повторять до бесконечности!

При методе ПЦР в пробирку с ДНК вносят смесь активированных нуклеотидов, фермент ДНК-полимеразу и так называемые праймеры — олигонуклеотиды, комплементарные концам размножаемой ДНК. При нагревании раствора цепи ДНК расходятся. Затем, при охлаждении, с ними связываются праймеры, образуя короткие фрагменты спиральных структур. Фермент присоединяет к праймерам нуклеотиды и собирает цепочку, комплементарную цепочке исходной ДНК. В результате реакции из одной двухцепочечной ДНК получается две. Если повторить процесс, получится четыре цепочки, а после n повторений — 2ⁿ молекул ДНК. Всё очень просто.

Изобретение ПЦР и разработка методов химического синтеза ДНК позволили создать потрясающую технологию молекулярной селекции. Принцип молекулярной селекции тоже прост: сначала синтезируется множество молекул, обладающих разными свойствами (так называемая молекулярная библиотека), а затем из этой смеси отбираются молекулы с желаемым свойством.

Библиотеки нуклеиновых кислот — это смеси молекул, имеющих одинаковую длину, но отличающиеся последовательностью нуклеотидов. Получить их можно в том случае, если при химическом синтезе на автоматическом синтезаторе добавлять на каждой стадии удлинения нуклеотидной последовательности одновременно все четыре нуклеотида. Каждый из них будет включаться в растущую нуклеиновую кислоту с равной вероятностью, в результате чего на каждом этапе присоединения будет получаться 4 варианта последовательностей. Если таким образом синтезировать нуклеиновую кислоту длиной в n звеньев, то разнообразие полученных молекул составит 4 в степени n. Поскольку обычно используются участки длиной 30–60 мономеров, то в результате синтеза получается от 4³⁰ до 4⁶⁰ разных молекул! Цифры, привычные разве для астрономов.

Так как в зависимости от состава нуклеиновые кислоты сворачиваются в разные пространственные структуры, синтез статистических последовательностей даёт огромное множество молекул, различающихся по свойствам. С образовавшихся ДНК — с помощью фермента РНК-полимеразы — считывается РНК. В результате получается библиотека уже одноцепочечных РНК. Далее производится процедура отбора: раствор РНК пропускается через колонку, в которой находится нерастворимый носитель с химически присоединёнными молекулами-мишенями, чтобы „выловить“ так называемый будущий аптамер, т. е. вещество, способное связывать определённые молекулы. Затем колонку промывают для удаления несвязавшихся РНК, и удаляют РНК, задержавшиеся на колонке за счёт связывания с целевыми молекулами (это можно сделать, например, нагревая колонку).

Принцип молекулярной селекции очень прост: сначала синтезируют несколько миллиардов (!) молекул нуклеиновых кислот одной длины, но разного состава, а потом из смеси отбирают молекулы с нужными свойствами. Чтобы получить РНК, способные связываться с определённым веществом, его молекулы прикрепляют к специальным колонкам. Раствор с РНК пропускают через колонку, и несколько молекул из множества непременно свяжутся с молекулами-„мишенями“. „Пойманные“ РНК — аптамеры можно выделить и затем размножить с помощью ПЦР.

С выделенных РНК делают ДНК-копии и получают из них обычные двуцепочеченые молекулы ДНК. С последних же можно считывать искомые РНК-аптамеры, а затем — размножать их методом ПЦР в неограниченных количествах. Конечно, так происходит в идеальном случае, на практике всё получается сложнее. Обычно исходный препарат РНК содержит огромный избыток „посторонних“ молекул, избавиться от которого трудно. Поэтому полученную РНК вновь и вновь пропускают через колонку, чтобы выделить РНК, образующие самые прочные комплексы с целевыми молекулами. С помощью такого метода были получены тысячи разных РНК-аптамеров, которые образуют специфические комплексы с различными органическими соединениями и молекулами.

Методом молекулярной селекции были выделены тысячи разных РНК-аптамеров, способных образовывать комплексы с самыми разными молекулами. а) аптамер, связывающий аминокислоту изолейцин; б) аптамер, связывающий аминокислоту тирозин; в) трёхмерная структура hammerhead рибозима (Dunham C.M., Murray J.B., Scott W.G., 2003)

Рассмотренная схема молекулярной селекции может быть применена для получения молекул с любыми свойствами. Например, были получены РНК, способные катализировать реакции синтеза РНК и белков: присоединение азотистых оснований к рибозе, полимеризацию активированных нуклеотидов на цепочках РНК, присоединение аминокислот к РНК. Эти исследования ещё раз подтвердили, что в условиях предбиологической эволюции из случайных полимеров могли возникать молекулы РНК со специфическими структурами и функциями.

Делайте ваш заказ!

Метод молекулярной селекции обладает очень большими возможностями. С его помощью можно решать задачи поиска нужных молекул даже в том случае, если исходно нет идеи, как такие молекулы должны быть устроены. Однако если придумать процедуру отбора, их можно выделить по принципу требуемых свойств, а затем уже заняться и вопросом, как эти свойства достигаются. Продемонстрируем это на примере выделения РНК, способных связываться с клеточными мембранами и модулировать их проницаемость.

Автоматический секвенатор ДНК — прибор, с помощью которого „читают“ гены.

Древние рибоциты должны были поглощать „питательные“ вещества из окружающей среды, удалять продукты метаболизма и делиться в ходе размножения. И все эти процессы требуют управления проницаемостью мембран. Поскольку мы полагаем, что никаких других функциональных молекул, кроме РНК, в рибоцитах не было, какие-то РНК обязательно должны были взаимодействовать с мембранами. Однако с химической точки зрения они совершенно не подходят для роли регуляторов проницаемости мембран.

Мембраны современных клеток и липосом, построенные из жирных кислот, несут отрицательный заряд. Поскольку РНК также заряжены отрицательно, то, по закону Кулона, они должны отталкиваться от липидной поверхности и, тем более, не могут проникать вглубь липидного слоя. Единственный известный способ взаимодействия нуклеиновых кислот с поверхностью мембран — через двухзарядные ионы металлов. Эти положительно заряженные ионы могут играть роль мостиков, располагаясь между отрицательно заряженными группами на поверхности мембраны и фосфатными группами нуклеиновой кислоты. Поскольку такие мостиковые взаимодействия достаточно слабые, с мембраной может связаться только очень большая нуклеиновая кислота, благодаря множеству слабых связей с поверхностью мембраны. Так маленькие враги привязали Гулливера к земле множеством тоненьких верёвок.

Тут и помог исследователям метод молекулярной селекции. Из библиотеки РНКудалось выделить несколько молекул, которые очень успешно связывались с мембранами, а при достаточно высокой концентрации — даже разрывали их! Эти РНК обладали необычными свойствами. Они как бы помогали друг другу: смесь молекул разных сортов связывалась с мембранами гораздо лучше, чем молекулы одного сорта. Всё стало ясным после изучения вторичных структур этих РНК. Оказалось, что в них имеются петли с комплементарными участками. За счёт этих участков „мембранные“ РНК могут формировать комплексы-сообщества, которые способны образовывать множественные контакты с мембраной и делать то, что одной молекуле РНК не под силу.

Отрицательно заряженные РНК могут взаимодействовать с отрицательно заряженными мембранами! Для этого они научились работать в „команде“: а) запись нуклеотидных последовательностей РНК, выделенных из препарата РНК, связывающегося с фосфолипидными мембранами; б) схема формирования „мембранного“ комплекса РНК на поверхности липосомы.

Этот селекционный эксперимент подсказал, что у РНК есть дополнительный способ приобретения новых свойств путём образования сложных надмолекулярных комплексов. Этот механизм мог использоваться и для удерживания эволюционирующих систем РНК в виде колоний на поверхностях ещё до того, как эти системы обзавелись изолирующей мембраной.

«Мир РНК»: был, есть и будет!

Множество данных свидетельствует о том, что „мир РНК“ действительно существовал. Правда, не совсем ясно — где. Некоторые специалисты полагают, что начальные этапы эволюции происходили не на Земле, что на Землю были занесены уже функционально активные системы, которые приспособились к местным условиям. Однако с химической и биологической точки зрения это не меняет сути дела. В любом случае остаётся загадкой — в результате каких процессов в окружающей среде рибоциты образовались и за счёт каких компонентов существовали. Ведь требуемые для жизни рибоцитов нуклеотиды — сложные молекулы. Трудно представить, что эти вещества могли образовываться в условиях пребиотического синтеза.

Вполне возможно, что древние РНК значительно отличались от современных. К сожалению, следов этих древних РНК экспериментально обнаружить нельзя, речь идёт о временах, удалённых от нас на миллиарды лет. Даже скалы тех времён давно „рассыпались в песок“. Поэтому речь может идти только об экспериментальном моделировании процессов, которые могли протекать на самых ранних стадиях молекулярной эволюции.

Почему произошёл переход от „мира РНК“ к современному миру? Белки, располагающие гораздо большим набором химических групп, чем РНК, являются лучшими катализаторами и структурными элементами. По-видимому, некоторые древние РНК стали использовать белковые молекулы в качестве „орудий труда“. Такие РНК, способные к тому же синтезировать для своих целей полезные молекулы из окружающей среды, получали преимущества в размножении. Естественным путём отбирались соответствующие аптамеры и рибозимы. А затем эволюция сделала своё дело: возник аппарат трансляции, и постепенно ответственность за катализ перешла к белкам. Орудия оказались столь удобными, что вытеснили своих „хозяев“ из многих сфер деятельности.

Читатель вправе спросить, — а зачем вообще нужно исследовать эволюцию РНК, ведь древний „Мир РНК“ исчез? Неужели только ради „чистого искусства“, удовлетворения интересов фанатичных исследователей? Однако, не зная прошлого, нельзя понять настоящее. Изучение эволюции и возможностей РНК может подсказать новые направления поиска процессов, протекающих в современных живых клетках. Например, совсем недавно были обнаружены мощные системы регуляции активности генов с помощью двуцепочечных РНК, с помощью которых клетка защищает себя от вирусных инфекций. Эта древняя система клеточной защиты, вероятно, скоро найдёт применение в терапии.

Поэтому неудивительно, что в наше время исследования нуклеиновых кислот продолжают оставаться одной из самых „горячих точек“ в молекулярной биологии. Благодаря уникальным свойствам, РНК находят всё более широкое применение в медицине и технике. Возникший в незапамятные времена „Мир РНК“ будет не только продолжать незримо существовать в наших клетках, но и возрождаться в виде новых биотехнологий.

Редакция благодарит сотрудников Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН: к. х. н. В.В. Коваля, к. х. н. С.Д. Мызину и к. х. н. А.А. Бондаря за помощь в подготовке статьи.

Об авторах:
Власов Валентин Викторович — действительный член Российской Академии Наук, доктор химических наук, директор Института химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения РАН, заведующий кафедрой молекулярной биологии Новосибирского государственного университета, лауреат Государственной премии РФ.
Власов Александр Валентинович — кандидат химических наук, научный сотрудник Института химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения РАН.

„Наука из первых рук “

Статьи близкой тематики:
Вначале была РНК? С. Григорович.
Происхождение и эволюция жизни на Земле. О. Г. Сорохтин, С. А. Ушаков.
Химические основы возникновения Жизни.
Биогенез: мотивы и феномены возникновения жизни. С. Б. Пашутин.
Сложность как мерило эволюционного прогресса. Владимир Бердников.
Ловчие сети эволюции. Николай Колчанов.
Поиски периодической системы… в эволюции. Сергей Инге-Вечтомов.
Микробы держат небо. Георгий Заварзин.
Неорганические полифосфаты. И. С. Кулаев.
Молекулярная эволюция. В. А. Ратнер.
Новое в теории появления жизни. В. Н. Пармон.
Естественный отбор среди молекул. В. Н. Пармон.
Жизнь создаёт планеты? В. Н. Снытников, В. Н. Пармон.
Фотопроцессы и первичные этапы химической эволюции органических молекул на Земле. М. Е. Акопян.
Рождённые из кристаллов? Николай Юшкин.
Когда погоду делал метан. Джеймс Кастинг.
Зарождение жизни на фоне космической бомбёжки. Ал Бухбиндер.
А есть ли жизнь на Земле? Рафаил Нудельман.
Каменная летопись биосферы. И. Резанов.
Эволюция в пробирке. А. В. Власов.
Недостающее звено. Е. Котина.
Пузырьки успеха. Д. Ласич, А. Омельченко, Л. Сечин.

кандидат биологических наук С. Григорович
Вначале была РНК?
В поисках молекулы первожизни

На самой ранней заре своей истории, когда человек приобрёл разум, а с ним и способность к абстрактному мышлению, он стал пленником непреодолимой потребности всё объяснить. Почему светят Солнце и Луна? Почему текут реки? Как устроен мир? Безусловно, одним из самых главных был вопрос о сути живого. Резкое отличие живого, растущего, от мёртвого, неподвижного, слишком бросалось в глаза, чтобы его можно было проигнорировать.

На каждом этапе истории люди предлагали своё решение загадки появления жизни на нашей планете. Древние, не знавшие слова „наука“, находили для неизвестного простое и доступное объяснение: „Всё, что есть вокруг, было когда-то и кем-то создано“. Так появились боги.

Со времён зарождения древних цивилизаций в Египте, Китае, затем и в колыбели современной науки — Греции, вплоть до Средних веков, основным методом познания мира служили наблюдения и мнения „авторитетов“. Постоянные наблюдения однозначно свидетельствовали, что живое при соблюдении определённых условий появляется из неживого: комары и крокодилы — из болотной тины, мухи — из гниющей пищи, а мыши — из грязного белья, пересыпанного пшеницей. Важно лишь соблюсти определённую температуру и влажность.

Европейские „учёные“ Средневековья, опираясь на религиозную догму о сотворении мира и непостижимости божественных замыслов, считали возможным спорить о зарождении жизни только в рамках Библии и религиозных писаний. Суть сотворённого Богом невозможно постичь, а можно лишь „уточнить“, пользуясь сведениями из священных текстов или находясь под влиянием божественного вдохновения. Проверять гипотезы в то время считалось плохим тоном, и всякая попытка подвергнуть сомнению мнение святой церкви рассматривалась как дело небогоугодное, ересь и святотатство.

Познание жизни топталось на месте. Вершиной научной мысли в течение двух тысяч лет оставались достижения философов Древней Греции. Наиболее значимыми из них были Платон (428/427 — 347 гг. до н. э.) и его ученик Аристотель (384 — 322 гг. до н. э.). Платон в числе прочего предложил идею одушевления изначально неживой материи благодаря вселению в неё бессмертной нематериальной души — „психеи“. Так появилась теория самозарождения живого из неживого.

Великое для науки слово „эксперимент“ пришло с эпохой Возрождения. Две тысячи лет понадобились для того, чтобы человек решился усомниться в непреложности авторитетных утверждений учёных древности. Одним из первых смельчаков, известных нам, стал итальянский врач Франсиско Реди (1626 — 1698). Он провёл чрезвычайно простой, но эффектный опыт: поместив в несколько сосудов по куску мяса, одни из них накрыл плотной тканью, другие — марлей, а третьи оставил открытыми. Тот факт, что личинки мух развивались только в открытых сосудах (на которые могли садиться мухи), но не в закрытых (к которым всё же был доступ воздуха), резко противоречил верованиям сторонников Платона и Аристотеля о непостижимой жизненной силе, носящейся в воздухе и превращающей неживую материю в живую.

Этот и подобные ему опыты положили начало периоду ожесточённых сражений между двумя группами учёных: виталистами и механистами. Суть спора состояла в вопросе: „Может ли функционирование (и появление) живого быть объяснено физическими законами, применимыми также и к неживой материи?“ Виталисты отвечали на него отрицательно. „Клетка — только из клетки, всё живое — только от живого!“ Это положение, выдвинутое в середине XIX века, стало знаменем витализма. Самое парадоксальное в этом споре то, что даже сегодня, зная о „неживой“ природе составляющих наш организм атомов и молекул и в общем согласившись с механистической точкой зрения, учёные не имеют экспериментального подтверждения возможности зарождения клеточной жизни из неодушевленной материи. Никому ещё не удалось „составить“ даже самую примитивную клетку из „неорганических“, присутствующих вне живых организмов, „деталей“. А значит, окончательную точку в этом эпохальном споре ещё предстоит поставить.

Так как же могла возникнуть жизнь на Земле? Разделяя позиции механистов, легче всего конечно же представить, что жизнь сначала должна была возникнуть в какой-нибудь очень простой, примитивно устроенной форме. Но, несмотря на простоту строения, это всё же должна быть Жизнь, то есть то, что обладает минимальным набором свойств, отличающих живое от неживого.

Каковы же они, эти критически важные для жизни свойства? Что, собственно, отличает живое от неживого?

Первый вирус, описанный Д. Ивановским в 1892 году, — вирус табачной мозаики. Благодаря этому открытию стало ясно, что существуют живые создания более примитивные, чем клетка.

До конца XIX века учёные были убеждены, что всё живое построено из клеток, и это является самым очевидным отличием его от неживой материи. Так считали до открытия вирусов, которые, хотя и меньше всех известных клеток, могут активно заражать другие организмы, размножаться в них и производить потомство, обладающее такими же (или очень похожими) биологическими свойствами. Первый из обнаруженных вирусов, вирус табачной мозаики, описан русским учёным Дмитрием Ивановским (1864–1920) в 1892 году. С той поры стало ясно, что более примитивные создания, чем клетки, могут также претендовать на право называться Жизнью.

Русский микробиолог Д.И. Ивановский (1864–1920), основоположник вирусологии.

Открытие вирусов, а затем и ещё более примитивных форм живого — вироидов позволило в итоге сформулировать минимальный набор свойств, которые необходимы и достаточны, чтобы исследуемый объект можно было назвать живым. Во-первых, он должен быть способен к воспроизводству себе подобных. Это, однако, не единственное условие. Если бы гипотетическая первородная субстанция жизни (например, примитивная клетка или молекула) была способна лишь просто производить свои точные копии, она в итоге не смогла бы выжить в меняющихся условиях окружающей среды на молодой Земле и образование других, более сложных форм (эволюция) стало бы невозможным. Следовательно, нашу предполагаемую примитивную „субстанцию первожизни“ можно определить как нечто, устроенное максимально просто, но при этом способное изменяться и передавать свои свойства потомкам.

Что же может претендовать на звание такой „первичной жизненной субстанции“? Совершим ещё один небольшой исторический экскурс, чтобы посмотреть, как сменялись „фавориты“, претендовавшие на звание первожизни.