Вид исследования | Цель исследования | Материал | Живая система для заражения | Культивируемый энтеровирус | Способ идентификации |
Вирусологическое | Выделение и идентификация вируса | Клинический материал: фекалии (ректальные тампоны), смывы с носовой части глотки (тампоны), спинно-мозговая жидкость, кровь, содержимое везикул, моча, асцитическая жидкость | Первичные культуры клеток почек обезьян, фибробластов эмбриона человека, переви- ваемые культуры клеток Vero, Hela, Hep-2, KB и др. | Полиовирусы 1- 3-го типов, Коксаки В 1-6-го типов, вирусы ECHO, Коксаки А (непостоянно) | РН со смесями поливалентных сывороток в культурах клеток и на мышах-сосунках; типовая принадлеж-ность вируса в РН с моновалентной сывороткой; РПГ, РИФ, РСК |
Секционный материал: кровь, спинномоз-говая жидкость, кусочки спинного, продолговатого мозга, варолиева моста, кусочки и содержимое кишок | Культура клеток | Вирусы Коксаки А и другие энтеровирусы | РПГ с эритроцитами человека 0 (I) группы крови, некоторые типы энтеровирусов (непостоянно) | ||
При подозрении на инфекции, вызванные ECHO и Коксаки — кусочки внутренних органов, печени, селезенки, легкого, миокарда, лимфати-ческие узлы | Однодневные мыши-сосунки | Вирусы Коксаки групп А и В | Данные патоморфологического исследования |
Полиовирусы (1—3-й), большинство вирусов Коксаки В, ECHO, некоторые типы вирусов Коксаки А (7-й, 9-й, 14-й, 16-й, 21-й) при размножении в культуре клеток почек обезьян оказывают ЦПД. В культуре клеток почек эмбриона человека, амниона человека, диплоидных клетках WI-38 репродуцируются вирусы Коксаки А (11-й, 13-й, 15-й, 18-й, 20-й, 21-й, 24-й), ECHO (21-й, 34-й). Большинство серотипов Коксаки А размножаются и вызывают ЦПД в культуре клеток RD (культура из рабдомиосаркомы человека). Для выделения вирусов Коксаки параллельно с культурами клеток заражают новорожденных мышей.
|
|
Вирусы Коксаки А из материала от больных наиболее успешно удается выделить только на однодневных мышах-сосунках, так как они не размножаются в большинстве культур клеток обезьян и человека.
Мышей-сосунков заражают в мозг (0,01 мл), подкожно (0,03 мл), внутрибрюшинно (0,05 мл) или комбинированным методом,. За инокулированными животными наблюдают 14 дней. При развитии клинических симптомов из мозга больных животных и тушек готовят 20 % суспензию для дальнейшего пассирования вируса. Берут также кусочки тканей для гистологического исследования.
Индикацию энтеровирусов проводят по ЦПД и бляшкообразованию под агаровым или бентонитовым покрытиями, в культуре клеток, развитию параличей у мышей-сосунков и их гибели, а также по физико-химическим свойствам: небольшие размеры, резистент-ность к жирорастворителям и низким значениям рН (3,0), термостабильность при температуре 50 °С в присутствии 1 М MgCl2 (магния хлорида).
|
|
Для идентификации энтеровирусов применяют РН, РТГА, РСК, РПГ, РИФ с типоспецифическими иммунными сыворотками.
РН проводят в культуре клеток или на мышах-сосунках по общепринятой методике.
Идентификацию штаммов вирусов Коксаки А. В и ECHO, обладающих гемагглютинирующими свойствами, осуществляют с помощью РТГА с использованием антигенов из зараженных клеточных культур и 1 % взвеси эритроцитов человека группы 0(І).
Для РСК вместо антисывороток применяют иммунную асцитическую жидкость мышей, обладающую меньшей антикомплементарностью.
РПГ дает хорошие результаты с антигеном, концентрированным в 200—400 раз.
Для концентрации энтеровирусов применяется бентонитовый метод. К 500 мл культуральной вируссодержащей жидкости добавляют 0,05—0,1 % геля бентонита по сухому весу сорбента, рН смеси доводят до 3,5—4,0 0,1 N раствором НС1. Смесь встряхивают 3—5 мин, центрифугируют при 2000—3000 об/мин в течение 10— 15 мин. Осадок (вирус-бентонит) отмывают 20—40 мл дистиллированной воды. Элюцию вируса осуществляют 0,05 М раствором трис-буфера (рН 9,0) при интенсивном встряхивании в течение 4— 5 мин. После этого смесь центрифугируют и исследуют надосадочную жидкость, в которой находится вирус. Этот метод позволяет сконцентрировать вирус в 100—200 раз.
Для серологической диагностики
применяют РН, РСК, РТГА. Диагностическое значение имеет 4-кратное и более увеличение титра антител. Результаты серологического исследования необходимо сопоставить с вирусологическими, эпидемиологическими и клиническими данными.
Для проведения РН смешивают 100 доз вируса с 2-кратными разведенными сыворотками больного. При проведении РН в культурах клеток результаты учитывают на 3—4-й и 7—8-й день, на мышах-сосунках — на 10—14-й день.
РСК используют для диагностики полиомиелита. Диагностическое значение имеет выявление антител в титре 1: 32 и выше, а также увеличение титра антител в 4 раза и более. Лучшие результаты дают непрогретые (малореактивные) антигены, полученные путем однократного замораживания и оттаивания инфицированных клеток после наступления полной специфической деструкции.
РТГА для серологической диагностики энтеровирусных инфекций применяется редко. Гемагглютинирующий антиген получают при высоком титре вируса (106 — 107 ЦПД50/МЛ). Сыворотки больных обрабатывают для удаления спонтанных гемагглютининов и неспецифических ингибиторов гемагглютинации.
Описано применение РИФ для исследования клеток спинномозговой жидкости. При ротавирусных инфекциях применяют ЭМ и ИЭМ (см. с. 243).
.