Взаимоотношения между микроорганизмами в ассоциированных пробиотиках. Каким образом осуществляется определение числа живых клеток в пробиотике?

В конкретных экологических условиях между разными группами микробов устанавливаются определенные взаимоотношения, характер которых зависит от физиологических особенностей и потребностей совместно развивающихся микробов. Кроме того, микроорганизмы вступают в различного рода взаимоотношения не только между собой, но и с простейшими, высшими растениями и другими группами организмов, составляющих почвенное население. В основном эти взаимоотношения можно условно подразделить на две большие группы: благоприятные — синергизм и неблагоприятные — антагонизм. Однако взаимоотношения между микробными сообществами далеко не всегда укладываются в рамки этих подразделений, так как они чрезвычайно сложны, разносторонни и вариабельны. Изменения во взаимоотношениях происходят вследствие изменений окружающих условий существования или в результате перехода микробов из одной стадии развития в другую. Можно отметить следующие формы взаимоотношений между микроорганизмами: сосуществование, метабиоз, симбиоз, конкуренция, хищничество, паразитизм, антагонизм. Биопленка – это конгломерат колоний микроорганизмов, которые погружены во внеклеточный матрикс и прикреплены к поверхности. Внутри биопленки возникают сложнейшие пищевые цепочки, где продукты жизнедеятельности одних микроорганизмов являются основой для существования других. Экстрацеллюлярный матрикс защищает микробов от воздействия внешних факторов, к которым относятся и наши попытки их уничтожения. Quorum Sensing и все такое.

Определение количества живых бактерий в поликомпонентных пробиотиках. Комбинированный метод (определение количества бифидо- и колибактерий)  

· Для определения количества живых бактерий в составе препарата пробиотика из соответствующих последовательных десятикратных разведений испытуемого образца в 0,9 % растворе натрия хлорида (с 10-1 по 10-9) проводят высевы на среду Блаурокка с натрия азидом (учет бифидобактерий) и на среду Эндо (учет колибактерий).  

· Для определения количества бифидобактерий по 1 мл микробной суспензии из разведений 10-6,10-7,10-8,10-9 высевают в пробирки, содержащие 9 мл полужидкой питательной среды Блаурокка с азидом натрия (отмечая разведение, из которого сделан посев). При этом учитывают, что разведение 10-6 препарата в 0,9 % растворе натрия хлорида соответствует разведению 106 в среде Блаурокка с азидом натрия. Посевы в среде Блаурокка с азидом натрия инкубируют при температуре (38  1) оС в течение 4 – 5 сут.

· Для определения количества кишечных палочек делают посев по 0,1 мл микробной суспензии из разведений испытуемого образца 10-5, 10-6 на чашки Петри со средой Эндо (по 2 чашки от каждого разведения). Суспензию равномерно распределяют по поверхности среды Эндо шпателем Дригальского до полного впитывания (высыхания) суспензии. Чашки закрывают и помещают перевернутыми вверх дном в термостат для инкубации. Посевы на среде Эндо инкубируют при температуре (37  1) оС в течение 18–24 ч.

Учет результатов. В среде Блаурокка с натрия азидом по окончании инкубации отмечают разведения, в которых имеется рост колоний в виде «гвоздиков». Количество живых бактерий в дозе вычисляют путем умножения количества колоний в пробирке на величину разведения микробной суспензии в данной пробирке. На среде Эндо по окончании инкубации производят подсчет выросших на чашках Петри колоний и вычисляют содержание живых бактерий в 1 дозе препарата. При подсчете учитывают чашки, на которых выросло не менее 15 колоний. Умножают среднюю арифметическую числа колоний на степень разведения и в том случае, если высев на чашку Петри сделан в объеме 0,1 мл, умножают на коэффициент 10 для пересчета на 1,0 мл.

ТАКОЙ ОТВЕТ ЕЩЕ

Сочетаемость пробиотиков друг с другом или с пребиотиками определяется как пробиотическим взаимодействием входящих в них штаммов защитной флоры, так и модификацией окружающей среды в кишечнике. Штаммы бактерий нормофлоры в составе комплексных препаратов или БАДов обладают синергическим или нейтральным эффектами относительно друг друга, будь то микроорганизмы разных или одного вида. Учитывая, что некоторые конкретные штаммы бактерий, входящие в состав поликомпонентных пробиотиков, входят также и в монокомпонентные препараты, то сочетанное потребление последних вполне допустимо. Так, бифидобактерии, входящие в бификол, составляют пробиотическую основу препаратов бифидумбактерин, бифидумбактерин в порошке, бифидумбактерин форте, бифилиз, пробифор и кисломолочных продуктов марки «Бифидок» (кефира, ряженки и др.). Кишечная палочка из препарата бифи-кол является основным действующим началом лекарственных средств колибактерина, биофлора и БАДа мутафлор. Лактобактерин также позитивно взаимодействует со всеми вышеуказанными бифидосодержащими пробиотиками, что было доказано при разработке нового поликомпонентного препарата, содержащего аналогичные штаммы лакто- и бифидобактерий. Бифидосодержащие препараты хорошо сочетаются с кефирами, как с обычными, так и с содержащими би-фидобактерии. И кефиры, и биойогурты обогащаются бифидобактериями на определенном этапе ферментации. Поэтому йогуртовые и кефирные закваски не оказывают на них подавляющего действия, и готовые продукты обладают двойным пробиотическим эффектом.

В результате проведенных исследований установлено взаимодействие пробиоти-ческих бактерий в смешанных культурах, которое выражалось в изменении их антимикробных и ростовых свойств. Обнаруженные эффекты позволяют рассматривать композицию пробиотиков, в которой штаммы-симбионты, взаимодействуя, могут выполнять различные функции - доминантного антагониста и ассоцианта-стимулятора, моделью для создания новых пробиотиков. Полученные результаты позволяют сформулировать следующие критерии отбора бактерий-ассо-циантов в качестве доминантных антагонистов для составления из них поликомпонентных пробиоти-ков: отсутствие выраженной АА в отношении друг друга; способность повышать ростовые характеристики доминантного(ых) антагониста(ов);способность стимулировать АА доминантного(ых) антагониста(ов).

Определение числа жизнеспособных бифидобактерий и
лактобацилл методом конечных разведений

Культуры пробиотических штаммов в виде закваски, бакконцентрата, биомассы в герметизированной упаковке закладываются на хранение при условиях как минимум двух температурных режимов (для сухих - минус 18 °С, 4 °С и 25 °С, для жидких - 4 °С, 9 °С) и подвергаются периодическим испытаниям на жизнеспособность, наличие посторонней микрофлоры, изучают морфологию клеток и активность кислотообразования.

Культуры засевают в соответствующие питательные среды в соответствии с общепринятыми методами анализа (НВЧ или серийных разведений) и по окончании инкубации культур, выросших на рядах пробирок с питательной средой, подсчитывали число колоний в трех конечных разведениях, в которых наблюдался рост изолированных колоний.

Общее число жизнеспособных клеток высчитывали по формуле:

X - число колониеобразующих единиц бактерий в 1 мл пробы;

а - число колоний в учитываемом разведении.