Иммуноглобулины. Методы определения содержания иммуноглобулинов разных классов

В ветеринарной лабораторной практике существует несколько методов определения иммуноглобулинов.

1. Количественное определение иммуноглобулинов методом радиальной иммунодиффузии в геле, содержащем моноспецифичную иммунную сыворотку (по Манчини). Суть методики: на стекляные пластины разливают раствор агара, содержащий моноспецифичную сыворотку, после застывания, в агаре делают лунки, в которые вносят исследуемую сыворотку крови животных. Затем пластины помещают во влажную камеру при 37оС и инкубируют в течение определенного времени. Далее замеряют диаметр образовавшихся колец преципитатов. В качестве стандарта используется сыворотка с известным количеством определенного иммуноглобулина.

2. Определение иммуноглобулинов методом дифференциального электрофореза в полиакриламидном геле (в модификации В.М.Холода, 1983). Принцип метода: разделяют белки в зависимости от заряда белковой мицеллы и размера молекулы.

3. Определение иммуноглобулинов в сыворотке крови путем осаждения цинком сульфатом или натрия сульфитом. Принцип метода основан на том, что при добавлении цинка сульфата или натрия сульфита происходит осаждение из сыворотки иммуноглобулинов. Образующееся при этом помутнение, интенсивность которого зависит от концентрации иммуноглобулинов, можно оценить с помощью колориметра или нефелометра. Методы эти простые, но недостаточно специфичные.

При некоторых патологических расстройствах наблюдаются значительные отклонения уровней иммуноглобулинов в крови. Концентрация Ig G возрастает во время инфекционных заболеваний, при некоторых болезнях печени и аутоиммунных растройствах. Уровень этих иммуноглобулинов снижается при гипо- и агаммаглобулинемиях, задержке развития и некоторых опухолях лим- фоидной системы.

Концентрация Ig M повышается при инфекционных заболеваниях, поражающих систему крови, при острых гепатитах и первичном билиарном циррозе. Снижается - при гипо- и агаммаглобулинемиях, некоторых опухолях лимфоидной системы.

Уровень сывороточного Ig A возрастает при заболеваниях дыхательных путей и кишечного тракта, при перитониальных инфекциях. Снижается - при гипо- и агаммаглобулинемиях, некоторых опухолях лимфоидной системы.

Иммуноглобулины - это гликопротеиды, секретируемые плазматическими клетками.

Выработка антител происходит, как правило, после антигенной стимуляции. Большинство антигенов вызывают одновременную стимуляцию нескольких клонов В-лимфоцитов - поликлональная стимуляция. Антитела, вырабатываемые одним клоном В-лимфоцитов, -моноклональные антитела - полностью идентичны.

Между антителами, которые вырабатываются разными клонами В-лимфоцитов, всегда есть какие-либо различия, например в строении участка связывания с антигеном или силе связывания с антигеном.

Известны 5 классов иммуноглобулинов: IgA, IgD, IgE, IgG, IgM. В основе строения молекулы иммуноглобулипа любого класса лежит Y-образная структура, состоящая из 2 тяжелых и 2 легких цепей, соединенных дисульфидными мостиками. "Ветви" молекулы (Fab-фрагмент) служат для связывания антигена, а "ствол" (Fc-фрагмент) выполняет другие биологические функции: активирует комплемент, связывается с клеточной мембраной и т. д.

IgG присутствуют в биологических жидкостях в виде мономеров. Они составляют большую часть иммуноглобулинов сыворотки и являются основным классом иммуноглобулинов, вырабатываемых при вторичном иммунном ответе.

IgE, также мономерные, участвуют в аллергических реакциях немедленного типа.

IgD находятся в основном на мембранах В-лимфоцитов и выполняют роль антигенраспознающих рецепторов, в сыворотке присутствуют в незначительном количестве в виде мономеров.

IgA содержатся в сыворотке преимущественно в виде мономеров, в секрете слизистых и молозиве - в виде димеров, содержащих также J-цепь и секреторный компонент, который синтезируется в эпителии слизистых. Димерный IgA соединяется с секреторным компонентом, проходя через эпителий на поверхность слизистой.

IgM присутствуют в сыворотке преимущественно в виде пентамеров. Они составляют основную долю иммуноглобулинов, вырабатываемых при первичном иммунном ответе.

Методы исследования иммуноглобулинов включают в себя определение уровня иммуноглобулинов различных классов и подклассов и антител к определенным антигенам. При оценке результатов исследования необходимо учитывать, что уровень иммуноглобулинов зависит от возраста. Изменение уровня иммуноглобулинов в сыворотке может быть следствием нарушения их синтеза, катаболизма или выведения.

Реакция радиальной иммунодиффузии. Иммунную сыворотку с расплавленным агаровым гелем равномерно наливают на стекло. После застывания в геле делают лунки, в которые помещают антиген в различных разведениях. Антиген, диффундируя в гель, образует с антителами кольцевые зоны преципитации вокруг лунок. Диаметр кольца преципитации пропорционален концентрации антигена. Реакцию используют для определения в сыворотке крови иммуноглобулинов различных классов, компонентов системы комплемента и др.

Иммуиоферментный анализ (ИФА) - выявление антигенов с помощью соответствующих им антител, конъюгированных с ферментом-меткой (пероксидазой хрена, бета-галактозидазной и или щелочной фосфатазой). После соединения антигена с меченой ферментом иммунной сывороткой в смесь добавляют субстрат/хромоген. Субстрат расщепляется ферментом и изменяется цвет продукта реакции - интенсивность окраски прямо пропорциональна количеству связавшихся молекул антигена и антител. Твердофазный ИФА - вариант теста, когда один из компонентов иммунной - реакции (антиген или антитело) сорбирован на твердом носителе, напр., в лунках планшеток из полистирола. Компоненты выявляют добавлением меченых антител или антигенов. При положительном результате изменяется цвет хромогена.

Достоинства ИФА: высокая чувствительность, позволяющая выявлять концентрации антигена до 10 пг/мл; высокая стандартность и воспроизводимость; возможность использовать минимальные объемы исследуемого материала; стабильность при хранении всех ингредиентов, необходимых для проведения ИФА (до года и более); простота проведения реакции; наличие как инструментального (в качественном и количественном варианте), так и визуального учета; возможность автоматизации всех этапов реакции; относительно низкая стоимость диагностических наборов и оборудования.