Выделение и количественная оценка лимфоцитов периферической крови у животных

Подсчет количества лейкоцитов производится в камере с сеткой Горяева. Относительное количество видов лейкоцитов определяется посредством микроскопии мазков крови, которые изготавливаются, фиксируются и окрашиваются по уже отработанной нами схеме. Дифференциация лейкоцитов проводится по морфологическим признакам, результат заносится в таблицу Егорова или фиксируется на клавишном счетчике.

Лейкограмма дает представление об относительном (в процентах) содержании различных видов лейкоцитов в крови, в т.ч. и лимфоцитов. Полученное процентное содержание лимфоцитов характеризуется как их относительная величина в популяции лейкоцитов крови. Зная общее количество лейкоцитов и относительное содержание лимфоцитов, вычисляется абсолютное число видов лейкоцитов, в т.ч. и лимфоцитов.

Определение относительного и абсолютного количества Т- и В- лимфоцитов крови. Т- и В-популяции лимфоцитов мало различимы при световой микроскопии. Вместе с тем эти клетки имеют отчетливые антигенные и функциональные различия. Т-лимфоциты обеспечивают клеточные реакции иммунитета, в частности реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) и реакции трансплантационного иммунитета. В-лимфоциты преимущественно отвечают за гуморальное звено иммунитета, они являются предшественниками антителпродуцирующих клеток.

Одним из методов определения числа Т- и В-лимфоцитов в крови является реакция розеткообразования. Суть феномена состоит в том, что при контакте Т-лимфоцитов с эритроцитами барана клетки формируют образования, напоминающие тутовую ягоду, которые принято называть розетками. В-лимфоциты также могут формировать розетки, но для этого нужны более сложные условия: эритроциты нагружаются комплексом аниген- антитело-комплемент.

Методика определения количества Т- и В-лимфоцитов включает следующие этапы:

- выделение лимфоцитов из периферической крови (отделение плазмы крови с лейкоцитами от эритроцитов, выделение лимфоцитов из крови на градиентах плотности центрифугированием, определение количества и жизнеспособности лимфоцитов);

- определение количества Т-лимфоцитов (приготовление эритроцитов барана, смешивание взвеси лимфоцитов и суспензии эритроцитов, приготовление, фиксация и окрашивание мазков, идентификация Т-лимфоцитов по образованию розеток (Е-РОК), расчет относительного и абсолютного количества клеток);

- определение количества В-лимфоцитов (приготовление эритроцитов барана, нагруженных комплексом анитело + комплемент, смешивание и инкубирование взвеси лимфоцитов и суспензии эритроцитов, приготовление, фиксация и окрашивание мазков, идентификация клеток по выявлению рецепторов к третьему компоненту комплемента (ЕАС-РОК), расчет количества В-лимфоцитов).

Определение фагоцитарной активности лейкоцитов (фагоцитарное число, фагоцитарный индекс).

Фагоцитарная активность лейкоцитов максимально выражена у нейтрофилов и, в меньшей мере, у моноцитов и зозинофилов. Фагоцитарная активность лейкоцитов зависит не только от функциональной активности клеточных элементов, но и от состояния внутренней среды организма. Интенсивность же фагоцитоза в значительной степени обусловлена активностью самих клеточных элементов.

Наибольшее распространение получила методика определения фагоцитарной активности клеток крови по Кост и Стенко. Принцип методики основан на том, что при контакте с чужеродными частицами гранулоциты и моноциты поглощают (фагоцитируют) и разрушают их внутриклеточными ферментами. Рассчитывают фагоцитарная активность, фагоцитарное число и фагоцитарный индекс (ФИ) нейтрофилов.

Получение клеточных суспензий. Определение жизнеспособных ЛФ в клеточной взвеси.

Лимфатические узлы (подмышечные, паховые, брыжеечные и др.), тимус или селезенку очищают от жира и соединительной ткани. Очищенные лимфатические узлы, тимус или селезенку переносят в чашку Петри или бюкс с небольшим количеством среды 199 (0,5 мл) и фрагментируют ножницами (можно осторожно ворсить скальпелем, разрывать препаровальными иглами или раздавливать в гомогенизаторе) до получения однородной клеточной взвеси. К полученной взвеси добавляют еще 2,5 мл среды 199 и фильтруют ее через капроновую сетку в центрифужную пробирку. Дважды отмывают средой 199 при центрифугировании в течение 5 мин при 1000 об/мин. Супернатант удаляют, а к осадку добавляют свежей среды 199 и ресуспензируют пастеровской пипеткой, шприцем с иглой или автоматическим дозатором. В полученной клеточной суспензии подсчитывают число ядросодержащих клеток в 1 мл и определяют их жизнеспособность

Определение жизнеспособности клеток

Определение жизнеспособности клеток производится методом суправитальной окраски 0,1% раствором трипановой сини.

Hа предметное стекло наносят каплю взвеси клеток и 1 каплю 0,1% раствора трипановой сини. Через 30-60 с окрашенную каплю взвеси покрывают покровным стеклом. Избыток суспензии удаляют промакиванием фильтровальной бумагой и под микроскопом подсчитывают число живых (неокрашенных) и погибших (синих) клеток на 100 кариоцитов. Выводят процент гибели клеток.

Раствор трипановой сини готовят заранее. Порошок растворяют в бидистиллированной воде из расчета получения 0,2% раствора, который фильтруют. Это маточный раствор. Рабочий раствор приготовляют перед опытом: маточный раствор разбавляют 4,25% раствором хлористого натрия до нужной концентрации (1 капля гипотонического физиологического раствора + 3 капли трипановой сини).