Определение креатинина в сыворотке крови по цветной реакции Яффе (метод Поппера)

Принцип. креатинин реагирует с пикриновой кислотой в щелочной среде с образованием окрашенных соединений. Интенсивность окраски пропорциональна концентрации креатинина.

Реактивы. Насыщенный раствор пикриновой кислоты. Товарная пикриновая кислота содержит 15-20% влажности. Кислоту не сушат из-за ее взрывоопасности! 2 г пикриновой кислоты растворяют в 100 мл горячей (70-80 ⁰С) дистиллированной воды (при нагревании в водяной бане). После этого раствор оставляют на 24 часа, периодически помешивая, а затем фильтруют. Реактив стоек при хранении в посуде из темного стекла;

Основной стандартный раствор креатинина: 100 мг креатинина растворяют в 100 мл 0,1 н. раствора соляной кислоты. Хранить в холодильнике в посуде с притертой пробкой. Для определения креатинина сыворотки крови стандартный раствор получают разведением основного раствора дистиллированной водой в 100 раз. 1 мл раствора содержит 0,01 мг креатинина (1 мг%);

10%-ный раствор натрия гидрооксида;

0,1 н. раствор соляной кислоты.

Оборудование. Фотоэлектроколориметр, центрифуга, водяная баня, колбы мерные.

Ход определения. 2 мл сыворотки крови смешивают с 6 мл насыщенного раствора пикриновой кислоты. Через 5 мин пробирку помещают на 15-20 мин в кипящую водяную баню, а потом центрифугируют. К 4 мл центрифугата добавляют 0,2 мл 10%-ного раствора натрия гидрооксида и тщательно смешивают. Иногда после подщелачивания раствор мутнеет вследствие выпадения фосфатов. В этом случае раствор еще раз центрифугируют. Затем доводят до объема 10 мл дистиллированной водой. Через 10 мин измеряют на ФЭКе в кювете с толщиной слоя 20 мм при длине волны 500-560 (зеленый светофильтр) против контроля.

Контроль – 3 мл насыщенного раствора пикриновой кислоты и 0,2 мл 10%-ного раствора натрия гидрооксида доводят до объема 10 мл дистиллированной водой.

Стандартную пробу обрабатывают точно так же, как и опытную, с той лишь разницей, что вместо сыворотки берут 2 мл рабочего (1 мг%) раствора стандарта. При этом пробу не центрифугируют. Стандартную пробу можно готовить так: к 1 мл рабочего стандартного раствора креатинина добавляют 3 мл насыщенного раствора пикриновой кислоты, 0,2 мл 10%-ного раствора натрия гидрооксида и 5,8 мл дистиллированной воды.

Расчет концентрации креатинина проводят по формуле:

Х=Еоп/Ест×1, где

Х – концентрация креатинина в сыворотке крови (мг%); Еоп – экстинция опытной пробы; Ест – экстинция стандартной пробы; 1 – концентрация креатинина в калибровочном растворе.

Клиническое значение. У здоровых животных концентрация креатинина в сыворотке крови колеблется от 0,45 до 1,8 мг%, у кур – от 1,4 до 4 мг%. По данным кафедры клинической диагностики и клинической биохимии ХГЗВА содержание креатинина в сыворотке КРС – 55-140, коз – 62-78, собак – 51-124, кошек – 70-140 мкмоль/л. В организме креатинин образуется из креатина (метилгуанидинуксусной кислоты) в результате дегидратации. Повышение его концентрации отмечается при почечной недостаточности, прогрессирующих диффузных заболеваниях почек, закупорке мочевых путей, голодании, мышечной дистрофии. Понижение концентрации креатинина клинического значения не имеет.