Определение протеина С

Таблица 26

Факторы, влияющие на резистентность к АПС

Обеспечение диагностики нарушений гемостаза в КДЛ

Скрининговые тесты на АПС разработаны на основе модифицированного теста АЧТВ, кото­рый проводится с и без АПС, или на основе ПВ со змеиным ядом.

Тест резистентности фактора Va к АПС на основе модифицированного АЧТВ

Добавление АПС в норме вызывает удлине­ние АЧТВ за счет инактивации факторов Va и Villa в плазме. Поэтому в тесте сравнивается вре­мя выпадения сгустка в тесте АЧТВ с добавлени­ем и без добавления АПС и рассчитывается от­ношение (рис. 114). Референтные значения теста зависят от используемых реактивов и приборов. Тем не менее, несмотря на разные методы и при­борную базу, обычно добавление АПС к плазме приводит, по крайней мере, к 2-кратному удли­нению АЧТВ (табл. 27).

Недостаточное удлинение АЧТВ (патологи­ческий результат, свидетельствующий о РАПС) наблюдается у пациентов с фактором V Лейден, волчаночным антикоагулянтом, при беременно­сти, увеличенном содержании фактора VIII и при-

еме оральных контрацептивов. Этот тест имеет специфичность для выявления фактора V Лейден примерно 80%, неполная специфичность связана с влиянием на результат других факторов, в част­ности с подавлением активности фактора VIIIa. На результаты теста оказывают влияние прием не­прямых антикоагулянтов и введение гепарина. Тест полезен для выявления пациентов с высоким риском тромбоэмболической болезни.

Тест для диагностики фактора V Лейден

Мутация гена фактора V (фактор Лейден) оценивается как наиболее распространенная при­чина РАПС. Эту патологию можно выявить при проведении теста на РАПС с плазмой пациента, разбавленной 1:5 плазмой с дефицитом ф.V. Этот тест обладает высокой специфичностью и чув­ствительностью на выявление фактора V Лейден (табл. 28).

Тест на РАПС проводится также с использова­нием змеиного яда, обозначаемого как протак (Рго-tac), специфически активирующего протеин С. При внесении активатора протеина С в смесь нор-

Примеры резистентности к активированному протеину С

Таблица 27

Таблица 28

Примеры определения резистентности к активированному протеину С методом без разведения и методом разведения испытуемой плазмы плазмой с дефицитом ф. V

Обеспечение диагностики нарушений гемостаза в КДЛ

мальной и дефицитной по ф.V плазмы время свер­тывания в тесте АЧТВ удлиняется примерно в 2 раза. Если имеется РАПС, удлинение АЧТВ вы­ражено в малой степени.

Для определения протеина С разработано несколько методов: иммунохимический метод, метод с хромогенным субстратом и коагуляцион-ный вариант. Для функциональных методов ис­пользуется специфический активатор протеина С из яда змеи щитомордника, обозначаемый как протак.

Определение протеина С с использованием хро-могенного субстрата

Рис. 113. Принцип определения протеина Сс использо­ванием хромогенного субстрата, АПС - активированный протеин С

Определение основано на активации протеи­на С активатором протак с последующим опре­делением (кинетическим методом или методом конечной точки) изменения оптической плотнос­ти пробы из-за образования паранитроанилина (рис. 113). Этот метод прост, специфичен, легко автоматизируется. Так как протеин С - витамин-К-зависимый гликопротеин, то при лечении не­прямыми антикоагулянтами (антагонистами ви­тамина К) появляются PIVKA-формы протеина С, которые не обладают антикоагулянтной актив­ностью, но определяются методами с хромоген-ными субстратами. Поэтому у больных, прини­мающих непрямые антикоагулянты, могут быть завышенными результаты определения протеина С хромогенными методами.

разцах исследуемой плазмы активируется про-таком. Для контроля тест проводится с и без протака (рис. 114). Активированный протеин С вызывает протеолиз и соответственно инактива­цию факторов Va и VIIIa в плазме (рис. 115). Последнее сопровождается удлинением времени свертывания в тесте АЧТВ, по которому оцени­вается активность протеина С в плазме пациен­та. Если фактор Va нечувствителен к активному протеину С, то АЧТВ не удлиняется в присут­ствии активатора протеина С. Рассчитывают отношение АЧТВ с протаком/АЧТВ без прота­ка, величина которого определяется в конкрет­ной лаборатории, так как тест зависит от исполь­зованных приборов и реактивов. Тем не менее этот коэффициент близок к 1 практически у всех больных с фактором Лейден и с дефицитом про­теина С и существенно выше 1 в случаях без де­фицита активности протеина С и при дисфунк­ции протеина S. Метод легко автоматизируется.

Коагуляционный метод оценивает актив­ность протеина С, фиксирующегося карбоксили-рованной частью на фосфолипидах. PIVKA-фор­мы не функционируют в этой системе, и тест не дает ложных результатов у пациентов, принима­ющих непрямые антикоагулянты или имеющих дефицит витамина К.

Исказить результаты теста могут такие фак­торы, как наличие мутации ф.V Лейден, присут­ствие в плазме волчаночного антикоагулянта,

Определение протеина С коагуляционным ме­тодом

Пробы пациентов сопоставляются с дефи­цитной по протеину С плазмой, которую полу­чают методом иммуносорбции. Протеин С в об-

Рис. 114. Принцип скрининга на резистентность к акти­вированному протеину С (РАПС). Активатор протеина С из змеиного яда (протак), добавленный к пробе, в норме существенно удлиняет АЧТВ, Если же имеет место РАПС, то удлинения АЧТВ в присутствии протака не происходит

Обеспечение диагностики нарушений гемостаза в КДЛ

Рис. 115.Принцип определения протеина С коагуляционным методом. АПС - активированный протеин С, ФЛ фосфолипиды

терапия гепарином. Для получения достоверных результатов очень важно качество используемой протеин-С-дефицитной плазмы.

У некоторых пациентов, принимающих не­прямые антикоагулянты, выявляются чрезвычай­но низкие цифры содержания протеина С. Эти результаты могут быть связаны не только с ис­тинным дефицитом протеина С, но и с развитием резистентности фактора Va к АПС.