Сибирская язва

Возбудитель (Bacillus аnthгасis) - неподвижная аэробная спорообразую­щая грамположительная бацилла. На питательных средах R-форма возбудителя образует длинные нити. Колонии на агаре округлые или неправильной формы с бахромчатыми краями. В МПБ цепочки оседают на дно и, среда остается про­зрачной. В организме бациллы окружены толстой капсулой, одиночны или соединены по 2-5 в короткие цепочке.

Материал для исследования: от павших животных - ухо, кровь из надреза уха; от трупа свиньи - заглоточные лимфатические узлы с окружающей тканью; пробы шерсти, кожевенно-мехового сырья, фуража, воды, почвы.

Исследование патологического материала проводят во внеочередном поряд­ке. Оно включает микроскопию мазков, посевы на питательные среды и зара­жение лабораторных животных. При необходимости ставят реакцию преципитации.

Посевы делают обычно в пробирки с МПБ и на косой агар, рН 7,2-7,4.

Ухо помещают на кювету, не снимая перевязки. Скальпелем делают надрез ко­жи, затем с помощью ножниц и пинцета разрезают и отделяют кожу, обнажая крупные вены. Пастеровской пипеткой набирают кровь из вены и делают посевы и мазки (см. микроскопические исследования и Культивирование бактерий).

Если проба крови прислана в виде мазка на стекле, ее полностью смывают физиологическим раствором, нанося его пипеткой несколько раз по 4-5 капель, собирают в стерильное часовое стекло или в пробирку и делают посевы, а затем мазке.

Из заглоточных лимфоузлов свиньи посевы и мазке-отпечатки делают обычным способом непосредственно из органа.

Мазки для микроскопии. Одну серию мазков фиксируют над пламенем и окрашивают по Граму, а другую фиксируют формалинизированным этиловым спиртом 15 мин или метиловым 5 минут и окрашивают на капсулы по Романовскому или другим способом.

Бактериологическое исследование. Посевы инкубируют при 37⁰с. В положительных случаях колонии возбудителя появляются на следующий день, а при отсутствии их роста посевы выдерживают в термостате еще двое суток.

Из типичных или подозрительных колоний делают отвивки в МПБ для по­становка реакций фаголизиса и «жемчужного ожерелья» и на косой агар. И остатков колоний готовят мазки и окрашивают по Граму и адсорбированной сибиреязвенной флуоресцирующей сывороткой ОКВС (см. Микроскопические исследования. иммунолюминесцентная микроскопия).

Если в первичных высевах на МПА характерных колоний нет, 1-2 капли бульонной культуры рассевают в чашки с МПА дробно по Дригальскому или другим способом, и инкубируют при 37⁰С. На другой день при наличии искомых колоний их исследуют, как указано выше.

Реакцию Фаголизиса ставят микрометодом или методом стекающей капли (см. Реакция фаголизиса), используя 3-6-часовые бульонные культуры изучаемых микробов.

Учет реакции по микрометоду проводят через 2-4 ч под микроскопом при увеличении 7Х8 и через 4-6 ч с помощью лупы Х2-ХЗ. учет реакции можно проводят и позднее через 12-24 ч.

Реакцию по методу стекающей капли учитывают через 6-8 ч, а окончательно - через 12-18 ч.

Проба «жемчужного ожерелья». Готовят чашки с хорошо просветленным агаром, содержащим пеницилина (см. Возбудитель сибирской язвы). Перед посевом на агаре по окружности чашки, ближе к краю, делают краем пробирки (слегка профламбировать) 6-8 насечек-дисков и маркируют их. Каж­дую бульонную 3-6-часовую культуру высевают петлей на свои диски в шесть чашек: две чашки с 0,5 ЕД пенициллина, две - с 0,05 ЕД и две чашки конт­рольные (эту пробу делают одновременно с постановкой реакции фаголизиса). Через 3 ч инкубации одну серию чашек с посевами исследуют под микроскопом.

Для удобства наблюдения культуры подкрашивают синькой Лёффлера (по капле краски на диск) 15-20 с; затем краску отсасывают, наносят на диски по капле физиологического раствора и накрывают покрывными стеклами. Микроско­пируют с объективом 40. Сибиреязвенные микробы шаровидны, синего или голу­бого цвета, среди них могут быть и палочки (мертвые клетки); все сапрофиты имеют обычную форму бацилл.

Проба «жемчужного ожерелья» в модификации Груз. К бульону Хоттингера, рН 7,2-7,4, добавляют 20-30% инактивированной ло­шадиной сыворотки и раствор пенициллина из расчета 0,5 ЕД/мл среды. Ее го­товят перед употреблением, разливают по 2 мл. В пробирки и в каждую высева­ют по две капли испытуемых культур. Посевы инкубируют 3 ч при 37⁰С, делают мазки на предметных стеклах, фиксируют жидкостью Карнуа до ее испарения, окрашивают синькой Лёффлера 20-30 с и промывают водой. Инкубацию посевов продолжают.

При отрицательных результатах того или иного варианта 3-часовой пробы исследуют таким же порядком 6-часовые культуры и делают окончательный вывод.

При необходимости выделенные культуры дополнительно проверяют: на ле­цитиназную активность - высевом в среду Дрожжевкиной; на гемолитическую ­активность - высевом на кровяной агар; на подвижность высевом в полужидкий агар; на характер роста - уколом в столбик желатины.

Биологическое исследование. Заражение лабораторных животных проводят. В день поступления пробы. Немедленно после посевов готовят заражающий материал в общем объеме 1-2 мл: а) кровь из уха, цельная или разбавленная равным объемом стерильного физиологического раствора или б) взвесь из па­ренхимы лимфоузла свиньи 1:2 в физиологическом растворе.

Материал вводят подкожно в область живота двум белым мышам по 0,1-­0,2 мл или двум морским свинкам (кроликам) по 0,5-1 мл. Зараженные жи­вотные гибнут через 1-3 суток, иногда позже. Наблюдение за зараженными жи­вотными ведут до 10 дней. Павших вскрывают немедленно. Из крови сердца, печени, селезенки и инфильтрата на месте инъекции материала делают высевы в МПБ, на МПА и мазки-отпечатки. Последние фиксируют, окрашивают по Граму и на капсулы и исследуют под микроскопом. Высевы при необходимости исследуют, как описано выше.

Реакция преципитации по Асколи. Ее ставят при отсутствии роста сибиреязвенных бацилл в первичных по пробы.

Перед экстрагированием сибиреязвенных антигенов свежий материал выдер­живают 18-20 ч при 37⁰С; для несвежего материала это не требуется. Сущест­вуют два способа экстрагирования.

Холодный способ: кусочки материала массой 1-2 г растирают в ступке с промытым стерильным кварцевым песком, переносят в колбочку. зали­вают 9-кратным количеством физиологического раствора с 0,3% карболовой кис­лоты и оставляют при комнатной температуре на 16-18ч. Этот способ более эффективный.

Горячий способ: 1-2 г материала мелко режут, помещают в пробир­ку, заливают 1:9 физиологическим раствором и выдерживают в кипящей водя­ной бане 30-40 мин. Полученный экстракт фильтруют через воронку диамет­ром 39 мм в пробирку. В качестве фильтра используют нейтральную асбестовую вату, набитую слоем в 1 см в горлышко воронки с таким расчетом, чтобы филь­трование экстракта завершалось через 1-2 ч и фильтрат был полностью про­зрачен. Первые капли фильтрата удаляют.

Проверку партии асбестовой ваты на нейтральность реакции проводят зара­нее: пробу асбеста заливают в пробирке дистиллированной водой, встряхивают

5 мин, воду сливают и лакмусовой бумажкой определяют ее реакцию. Если ре­акция кислая или щелочная, асбест промывают дистиллированной водой, отжи­мают и вновь проверяют реакцию, повторяя промывание до нейтральной ре­aкции.

Для ускорения исследования полученный тем или иным способом экстракт фильтруют в шприце на 5-10 мл (без иглы) через слой асбестовой ваты тол­щиной около 1 см, плотно набитый в цилиндр поршнем. Фильтрование ведут под легким давлением поршня. Прозрачный фильтрат собирают в пробирку. Экст­ракт даже со следами помутнения надо перефильтровать.

Реакцию ставят и пробирках Уленгута путем подслаивания или наслаива­ния. При подслаивании в пробирку сначала вносят 0,2-0,3 мл экстракта, затем под него через тонко оттянутый капилляр пастеровской пипетки, опущенный до дна пробирки, медленно подслаивают равный объем преципитирующей сыворот­ки. При наслаивании в пробирку сначала вносят сыворотку, а затем через оття­нутый капилляр пипетки осторожно по стенке вносят в таком же объеме экст­ракт. В обоих случаях пробирку надо держать наклонно. Линия разделения ком­понентов (смотреть на темном фоне) должна быть четкой и тонкой, в против­ном случае реакцию повторяют. В случаях не позже чем через 15 мин на границе между компонентами появляется тонкий слой помутнения.

Контроли реакции: а) сыворотка плюс стандартный сибиреязвенный антиген; положительная реакция должна наступить не позже чем через 1-2 мин; б) сыворотка плюс физиологический раствор.

Исследование шерсти. Наиболее загрязненные комки и пряди шерсти поме­щают в ступку, увлажняют небольшим количеством физиологического раствора, измельчают ножницами и переносят в колбу с бусами емкостью 100 мл, напол­нив ее до половины. Заливают физиологическим раствором из расчета получить 12-15 мл смыва, плотно закрывают и тщательно встряхивают в течение 10 мин.

Дальнейшую обработку смыва и высевы проводят, как указано ниже.

Исследование кожевенно-мехового сырья. Из исследуемой шкуры в 2-3 ме­стах берут кусочки общей массой 1 г, помещают в чашку Петри, слегка увлаж­няют физиологическим раствором и состригают с них шерсть. Затем кусочки по­мещают в ступку, заливают 5 мл физиологического раствора, разминают пести­ком и дают постоять 2-3 ч для размягчения. Добавляют 0,5 г стерильного промытого кварцевого песка, 5-7 мл физиологического раствора и тщательно растирают до получения волокнистой мезги. Мезгу отжимают на внутренней поверхности ступки и удаляют.

Полученной взвесью заражают подкожно двух белых мышей, а остаток ее центрифугируют при 3000 об/мин 30 мин. 2/3 центрифугата сливают, а оставшую­ся жидкость с осадком переносят в пробирку и прогревают на водяной бане при 65⁰С 30 мин 0,5 мл взвеси после ее охлаждения дробно высевают в 4-5 чашек с МПА.

Высевы из шерсти и шкур инкубируют при 37⁰С. Через 18-24 ч чашки просматривают с помощью лупы, отбирают подозрительные колонии и исследу­ют их, как описано выше.

Исследование воды, фуража и почвы проводят,как указано в посевах из материалов внешней среды.

Для проведения экспресс-анализа после фильтрования смыва отрезают 1/4 часть мембранного фильтра и накладывают осадком вверх на 0,7 или 2%-ный МПА, предварительно увлажненный каплей МПБ. С остальной части фильтра делают смыв и используют, как указано выше.

Если смыв центрифугировали, то в чашку с МПА кладут два стерильных мембранных фильтра, №3 или 2, на один наносят 2-3 капли из верхнего слоя центрифугата, а на другой столько же из осадка. Чашки с фильтрами инкуби­руют 4 ч при 37⁰С, смывают налет с фильтра двумя каплями физиологического раствора и делают мазки, которые после фиксирования формалинизированным спиртом окрашивают не адсорбированной сибиреязвенной флуоресцирующей сы­вороткой промывают и заключают в глицерин, рН 8,0, под покровное стекло. Данные микроскопии при экспресс-анализе являются предварительными и долж­ны быть уточнены микроскопией мазков из колоний, окрашенных адсорбирован­ной флуоресцирующей сывороткой ОКВС.