Туберкулез

Возбудители - Mycobacterium Вovis, М. tubercu1osis, М. avium - тонкие пря­мые или слегка изогнутые неподвижные палочки. Спор и капсул не образуют. Грамположительны, устойчивы к спиртам и кислотам.

М. bovis чаще вызывает болезнь у крупного рогатого скота, свиней, верблю­дов, оленей, маралов, овец, коз и лошадей. М. tuberculosis выделяют у свиней, кошек, собак и крупного рогатого скота, а М. avium - у птиц, свиней и редко у крупного и мелкого рогатого скота и у лошадей.

Родственные им сапрофитные микобактерии часто встречаются в выделе­ниях из организма, кормах, воде, навозе, торфе и пр. Те и другие микробы внешне неразличимы и почти в равной мере кислото и спиртоустойчивы, что затрудняет лабораторную диагностику туберкулеза. Ее проводят только для по­становки первичного диагноза в ранее благополучных хозяйствах.

Материал для исследования: от свежих трупов и убитых животных - кусоч­ки печени, селезенки, легкого, лимфоузлы заглоточные, подчелюстные, бронхи­альные, средостенные, брыжеечные, почечные, надвыменные; парные лимфоузлы берут с обеих сторон; при необходимости исследуют молоко, мокроту, мочу, фе­калии; от птиц - печень, селезенка, легкое, яичники, целиком тушки (трупы).

Консервация - в 30 % -ном стерильном водном растворе химически чистого глицерина или зимой - замораживание.

Исследуют бактериоскопически, бактериологически и биологически. При ис­следовании материала от нескольких животных фермы можно ставить общую биопробу.

Бактериоскопию проводят, прежде всего с помощью методов световой и лю­минесцентной микроскопии для световой микроскопии делают по два мазка из каждого органа (лимфоузла) путем растирания кусочка из органа или мокроты между двумя пред­метными стеклами. Из обогащенных суспензий мазки делают петлей. Мазки су­шат на воздухе, фиксируют над пламенем и окрашивают по Цилю - Нильсену. Для люминесцентной микроскопии мазки делают и фиксируют также; окраши­вают по О. А. Поляковой

Подготовка материала к исследованию обязательна.

Обработка материала. Ее проводят обязательно в целях концентрации воз­будителя, уничтожения сопутствующей микрофлоры и гомогенизации материала, применяя щадящие для патогенных микобактерий средства. В зависимости от загрязненности материала посторонними микробами выбирают тот или иной метод обработки материала для бактериологического и биологического исследовании ту или иную концентрацию серной кислоты для уничтожения неустойчивых к ней бактерий.

Кусочки органов и тканей промывают дистиллированной водой от консерван­та (или берут свежий материал), измельчают в ступке ножницами, растирают пестиком и заливают 1: 4 водным раствором серной кислоты (мало загрязнен­ые - 3%-ным, сильно загрязненные - 6-l0%-ным); затем центрифугируют при 1000 об/мин 10-15 мин. Общая выдержка материала в кислоте не более 30 мин. Подосадочную жидкость сливают, а осадок суспендируют в равном объеме фи­зиологического раствора и используют для посева и приготовления мазков для­ микроскопии (метод Гона) или перед посевом осадок дополнительно промывают 1-2 раза физиологическим раствором с помощью центрифугирования при выше указанном режиме (метод Левенштейна - Сумийоши).

По методу А. П. Аликаевой ткани разрезают на кусочки 0,5 см³, помещают в ступку, заливают 3-б% -ным paствором серной кислоты на 10-20 мин и на­крывают ступку листом стерильной пергаментной бумаги. Затем кислоту сли­вают, кусочки промывают физиологическим раствором 5 мин, отсасывают его, а кусочки тщательно растирают с незначительным объемом свежего физиологического раствора и делают посевы и мазки.

Молоко в объеме 150 мл центрифугируют при 3000 об/мин 20-30 мин.

Средний слой отсасывают, а из осадка и жирового слоя делают мазки. Их пе­ред окрашиванием обезжиривают эфиром в двух сменах в течение 20-30 мин. 3атем осадок обрабатывают 3-б%-ным раствором серной кислоты, или 15%-ным раствором ортофосфорной кислоты, или 4%-ным раствором едкого натра 10-­15 мин, тщательно взбалтывают и центрифугируют при 3000 об/мин 10-15 мин. Центрифугат сливают, из осадка делают посевы.

Яйца. Желток обрабатывают по методу Гона и высевают. Яйца можно ин­кубировать 20 дней при 37--38 ОС, затем обработать по Гону и сделать посевы.

Мокроту, слизь, гной заливают равным объемом 10%,ного раствора трех­замещенного фосфата натрия, хорошо перемешивают и помещают в термостат на 24 ч. Полученный гомогенат центрифугируют при 3000 об/мин 10-15 мин. Из осадка делают посевы и мазки.

Мочу (200 мл) центрифгируют при том же режиме или отстаивают сутки в холодильнике для образования осадка. К осадку прибавляют 3-5 мл 3-6%-ной серной кислоты, встряхивают 5-10 мин и центрифугируют при 3000 об/мин 10 мин. Из осадка делают посевы и мазки.

Фекалии можно обрабатывать двумя способами.

1. Метод Венота и Моро. Фекалии 2-4 г растирают в ступке, разбавляют 25%-ным раствором хлорида натрия до жидкой консистенции, пропускают через марлевый фильтр, берут в центрифужную пробирку 3-5 мл фильтрата, добав­ляют 1 мл петролейного эфира или авиационного бензина, перемешивают, плот­но закрывают корковой пробкой и центрифугируют при 3000-5000 об/мин 15­25 мин. Материал для посевов и мазкок берут из нижней части образовавше­гося кольца.

2. Метод Маккавейской. 50 r фекалий в стерильной ступке размешивают с 18%-ным раствором серной кислоты до жидкой консистенции. Через 10 мин процеживают через марлевый фильтр. Фильтрат центрифугируют при 3000­5000 об/мин 12-15 мин (воздействие кислотой должно продолжаться не более 30 мин).

Из осадка делают мазки для микроскопии, затем осадок промывают 1­2 раза физиологическим раствором на центрифуге при том же режиме и высевают.

Концентрирование микобактерий с помощью флотации. Предварительная об­работка материала: а) кусочки тканей после удаления жира растирают в ступке с физиологическим раствором до консистенции сметаны; б) мочу центрифугиру­ют при 3000 об/мин 30 мин или отстаивают сутки на холоде и используют оса­док; в) мокроту, гной и слизь разводят 3-б-кратным объемом 0,5-2%-Horo рас­твора едкого натра; г) фекалии растирают с дистиллированной водой, пропус­кают через марлевый фильтр и используют фильтрат.

Посуду и стекла для флотации выдерживают 10 мин в сушильном шкафу при 200⁰с.

Техника флотации: в узкогорлую бутылку емкостью 250 мл вносят 10 мл исследуемого материала, добавляют равный объем 1 %-ного раствора едкого нат­ра и плотно закрывают. Смесь тщательно встряхивают в специальном аппарате или вручную до гомогенизации, но не более 10 мин. Затем взвесь разводят 1: 10 дистиллированной водой и прибавляют 1-2 мл ксилола, или авиационного бен­зина, или петролейного эфира. Затем смесь вновь встряхивают 5-10 мин, добавляют дистиллированную воду до горлышка бутылки и оставляют на 30 мин при комнатной температуре. За это время капельки ксилола (эфира, бензина) всплывают, увлекая за собой микобактерии, и образуют флотационное кольцо в горлышке бутылки.

Для приготовления мазков содержимое кольца отсасывают пипеткой и на­носят по мере подсыхания несколько раз на предметные стекла.

Для посевов пенистую часть флотационного кольца переносят пипеткой в пробирку, добавляют равный объем 31-6%-ного раствора серной кислоты, тща­тельно встряхивают 3-5 мин и дают отстояться 10 мин. Содержимое вновь образовавшегося компактного кольца высевают петлей-ракеткой в пробирки с питательной средой.

Бактериологическое исследование. Поступивший материал от каждого жи­вотного отдельно тщательно осматривают, прощупывают и отбирают пробы:

а) из органов и тканей, в которых обнаружены подозрительные изменения, вырезают кусочки 0,5-1 см^З с измененными и прилегающими к ним неизменен­ными участками. Пробы составляют раздельно из органов и лимфоузлов;

б) если в органах изменений не выявлено, обязательно исследуют ткани легкого и лимфоузлов: портального с прилегающей тканью печени, заглоточных, подчелюстных, средостенных, бронхиальных и брыжеечных.

Материал для исследования отбирают в количестве, достаточном для посе­вов и биопробы (не менее 12 г). Исходный материал сохраняют в консерванте при 2-4 ос до окончания экспертизы.

Обработку отобранного материала проводят, как указано выше.

Посевы. Для выращивания микобактерий туберкулеза используют плотные яичные питательные среды Левенштейна - Йенсена, Петраньяни, Гельберга, а также жидкую среду Школьниковой.

Важно, чтобы во время инкубации (до 30 дней, а прн запоздалом росте до 3 месяцев) плотная среда сохраняла достаточную влажность. Поэтому высев делают в пробирки со значительным конденсатом; если его мало или нет, перед посевом добавляют 0,6-0,7 мл полусинтетической жидкой питательной среды или физиологического раствора. Обработанный материал каждой пробы высева­ют по 3-4 капли в 5-10 пробирок с плотной средой и, держа пробирку гори­зонтально, петлей или пастеровской пипеткой осторожно растирают материал по всей поверхности среды. Засеянные пробирки укладывают наклонно и помещают в термостат при 37-38⁰С.

После посевов из материала делают мазки и готовят взвесь для биопробы. Посевы через два дня просматривают и учитывают восстановление цвета среды. Если цвет ее не изменился, обработку исходного материала и посевы повторяют. Пробирки, В которых есть рост посторонних микробов удаляют, а в остальных пробки обрезают острым скальпелем, углубляют их на 2-3 мм в пробирку и заливают расплавленным парафином или ватно-марлевые пробки заменяют стерильными резиновыми.

Для выделения культур микобактерий на среде Школьников ой материал об­рабатывают по Левенштейну - Сумийоши и высевают в 6-8 пробирок с кровя­ной средой Школьниковой (см. Возбудители туберкулеза). Посевы инкубируют при 37-38⁰С. Через каждые 6-8 дней среду с посевом (по 1 пробирке) цент­рифугируют при 3000 об/мин 20-30 мин. Осадок промывают стерильной дистил­лированной водой на центрифуге при том же режиме и из осадка готовят мазки и делают посевы в 5-10 пробирок с плотной яичной средой для получения мак­рокультур.

Инкубируемые посевы просматривают не реже одного раза в неделю. Рост микобактерий наблюдается через 10-30 дней, нередко позднее. Посевы выдерживают в термостате до 3 месяцев, после чего при отсутствии роста с поверх­ности среды делают мазки и окрашивают по Цилю - Нильсену, Если в мазках обнаруживают кислотоустойчивые палочки, делают пересевы на свежую яичную среду.

Из полученной первичной генерации микобактерий готовят мазки, окрашивают; по Цилю - Нильсену и микроскопируют с целью проверки чистоты культуры, после чего делают по шесть посевов на яичную среду, в МПБ, на МПА и инкубируют по два посева в каждую среду при 20-25, 37-38 и 45⁰С.

Техника пересева. Петлей осторожно у пламени снимают 1-2 петли бактерийной массы, переносят в стерильную центрифужную пробирку, тщатель­но растирают стеклянной палочкой и суспендируют в физиологическом раство­р, доводя концентрацию микобактерий до 10 мг/мл по оптическому стандарту для вакцины БЦЖ (выпускается Гос. НИИСиК, биопрепаратов им. Тарасевича) 3-4 капли взвеси вносят пипеткой в каждую пробирку с питательными средами (всего 18). Пробирки маркируют с указанием культуры, даты пересева и температуры выращивания. Пробки срезают и парафинируют.

Наличие роста в посевах учитывают через каждые 2-3 дня в течение пер­вых десяти дней и каждые пять дней в последние 15 дней.

Ускоренное обнаружение туберкулезных бактерий в посевах по О. А. Полякрвой. Подготовленные взвеси (см. выше) высевают петлей на нитроцеллю­лозные мембраны №3 или № 4, помещаемые на свежескошенную среду Пет­раньяни, каждую взвесь - в пять пробирок. Перед посевом мембраны разреза­ют на три равные полоски, вымачивают в дистиллированной воде в течение су­ток, кипятят в химическом стакане или эмалированной кастрюле в трех сменах дистиллированной воды по 30 мин в каждой. Полоски накладывают на среду, опустив нижний конец в конденсат, и засевают. Контрольный высев делают на МПА. Инкубация при 37-38⁰С.

На 3, 7 и 10-й день выращивания стерильным пинцетом снимают по одной полоске, кладут на предметные стекла, фиксируют над пламенем и окрашивают аурамин-родамином по Поляковой 15 мин. При промывании полоску придержи­вают пинцетом, а воду подают на край стекла, чтобы не смыть микробов. Го­товые препараты просушивают и микроскопируют. Микроколонии туберкулезных микобактерий обнаруживают уже через 10 дней, а иногда и раньше.

Биологическое исследование. Оставшуюся от посевов взвесь (ранее обрабо­танную по Гону или Левенштейну - Сумийоши или Аликаевой) подвергают дополнительной обработке: нейтрализуют реакцию суспензии до рН 7,0 10%-ным водным раствором двууглекислого натрия, отстаивают до оседания крупных частиц и надосадочную жидкость используют для заражения лабораторных жи­потных. Объем суспензии готовят из расчета, чтобы на одну дозу (1-2 мл) был использован 1 г исследуемого материала.

При исследовании молока после его центрифугирования берут верхний слой и осадок, смешивают и разбавляют физиологическим раствором до консистенции, годной для инъекции морским свинкам. Молоко от коров, страдающих мастита· ми или другими заболеваниями вымени инфекционной природы, обрабатывают кислотами или едким натром, как указано выше. Осадок, оставшийся после по­сева, нейтрализуют 10%-ным раствором двууглекислого натрия (см. выше) или 3%-ным водным раствором соляной кислоты и вводят морским свинкам,

В случае постановки биопробы при исследовании мокроты, мочи, фекалий и других материалов их обрабатывают, как указано выше, а оставшуюся от посева взвесь нейтрализуют двууглекислым натрием и вводят морским свинкам.

Биопробу применяют для обнаружения возбудителей туберкулеза в иссле­дуемом материале, определения их вида и установления вирулентности. Патоло­гический материал, в котором обнаружены изменения, и каждую выделенную культуру микобактерий проверяют.отдельно. Если в материалах изменений нет, составляют общую пробу от 2-3 животных одного стада. Для биопробы ис­пользуют кроликов массой не менее 2 кг, морских свинок (желательно светлой масти) - 300-350 г и кур не моложе 5 месяцев.

При диагностическом исследовании материала от реагировавших на туберку­лин животных из благополучных хозяйств в случаях отрицательного или сомнительного патологоанатомического диагноза, а также материала, взятого при жизни животных, биопробу ставят на 3-5 морских свинках, 3-5 кроликах и 3-5 курах.

При определении вида возбудителя или выделенной культуры микобактерий биопробу ставят на трех морских свинках и трех кроликах, а если необходимо, то и на трех курах. Культуру, выделенную от птиц, проверяют на трех курах,

Исследуемый материал вводят по 1-2 мл морским свинкам подкожно в область паха, кроликам - в краевую вену уха, курам - в подкрыльцовую вену. Нативный материал, а также подвергнутые предварительной обработке молоко, мокроту, фекалии, мочу вводят только морским свинкам. Культуру микобактерий вводят в дозе 1 мг микробов, суспендированных в 1 мл физиологического раствора (приготовление взвеси см. ниже).

Чтобы исключить естественный туберкулез, морских свинок и кур перед зара­жением проверяют аллергической пробой. С этой целью морским свинкам снару­жи бедра или на животе внутрикожно вводят альттуберкулин для млекопитаю­щих в объеме 0,1 мл, предварительно разведенный 1:10 физиологическим рас­твором. Накануне в месте введения выщипывают шерсть. Реакцию учитывают через 24 и 48 ч. Курам вводят туберкулин для птиц внутрикожно в бородку в дозе 0,1 мл. Учет реакции через 30-36 ч. Для введения туберкулина приме­няют шприц на 1 мл с бегунком и иглы для внутрикожных инъекций (№ 0415).Наблюдение за животными ведут до 3 месяцев.

При появлении клинических признаков туберкулеза у зараженных морских свинок их через 30 дней исследуют туберкулиновой пробой, как указано выше. Одну из свинок убивают, из пораженных участков органов и лимфоузлов готовят мазки и окрашивают по Цилю - Нильсену или для люминесцентной микроско­пии.

Если результаты вскрытия и микроскопии сомнительны или отрицательны, из органов делают посевы на плотные яичные среды. При необходимости перед по­севом из органов вырезают кусочки и обрабатывают по методу Аликаевой (см. выше), но для обработки берут 2%-ный раствор серной кислоты.

При развитие туберкулезного процесса у кур им через 30 дней вводят туберкулин для птиц, как указано выше. Реагирующих убивают, вскрывают и делают мазки для бактериоскопии.

Для заражения животных выделенными культурами микобактерий готовят суспензию из 3-4 недельной культуры. Культуру снимают шпателем с плотной среды, отжимают пинцетом между четырьмя слоями стерильной фильтровальной бумаги, переносят в пакетик из такой же бумаги и отвешивают на торзионных весах микробную массу из расчета 10-20 мг на одно животное. Навеску расти­рают в ступке сначала с небольшим объемом физиологического раствора или бычьей желчи, а затем разводят физиологическим раствором до концентрации 1 мг/мл. Животным вводят по 1 мл взвеси (технику введения см. выше).

Очень влажную или слизистую микробную массу суспендируют в физиоло­гическом растворе, доводят до концентрации 10 единиц мутности по оптическому стандарту и вводят животным по 1 мл.