А Задание студентам

1. Указать приспособления (виды тампонов) для взятия материала при менингококковой инфекции, коклюше и дифтерии.

2. Микробиологическое исследование при менингокок­ковой инфекции:

1) указать материал, подлежащий исследованию;

2) бактериоскопический метод: микроскопировать го-

♦ Обнаружение растворимых антигенов легионелл. Антиге­
ны возбудителя могут присутствовать не только в мате­
риале из очага инфекции, но также в крови и моче и
выявляются с помощью чувствительных серологических
реакций (ИФА, РИА).

Биохимические и молекулярно-биологические исследования. Исследуемый материал, полученный из очага инфекции, используют для обнаружения ДНК возбудителя с помощью ПЦР. В случае обнаружения соответствующих моле­кул можно поставить предварительный диагноз.

Серодиагностика, Для определения антител используют ме­тод непрямой ИФ с антигеном из легионелл. Диагностическое значение имеет титр антител 1:32 и более и нарастание его в 4 раза и более в динамике заболевания. Реже применяют другие серологические реакции (ИФА, РИГА, микроагглютинации и ДР-)-

• Диагностические, профилактические и лечебные препараты

Диагностические сыворотки противопневмококковые типоспе-цифические I, II и III типов. Используют для типирования (установления серовара) стрептококков пневмонии.

Поливалентная полисахаридная пневмококковая вакцина.

Включает капсульные полисахаридные антигены 23 наиболее распространенных сероваров S.pneumonia.

Диагностикумы клебсиеллезные для РСК и РИГА.

Поливалентная полисахаридная клебсиеллезная вакцина. Включает капсульные полисахаридные антигены 24 наиболее распространенных сероваров K.pneumonia подвида pneumonia.

Риккетсиозный сухой растворимый антиген С. burnetii для РСК и РНГА. Обладает более высокой активностью, чем риккетси­озный диагностикум.

Орнитозный диагностикум для РСК.

Микоплазменный диагностикум для РСК и РНГА.

Сухая живая вакцина М-44. Высушенная взвесь вакцинного штамма С.burnetii, выращенного в курином эмбрионе. Приме­няют для профилактики Ку-лихорадки.

Антибиотики: р-лактамы, макролиды, аминогликозиды, тет-рациклины, сульфаниламиды, хинолоны и др.

Тема 14.2. ВОЗБУДИТЕЛИ МЕНИНГОКОККОВОЙ ИНФЕКЦИИ, КОКЛЮША И ДИФТЕРИИ

▲ План

▲ Программа

1. Биологические свойства возбудителей менингококко-вой инфекции, коклюша и дифтерии; их патоген-

ность, экология, особенности инфекции и эпидемио­логия вызываемых заболеваний.

2. Микробиологическая диагностика.

3. Диагностические, профилактические и лечебные пре­параты.

▲ Демонстрация

1. Приспособления и тампоны (простые, проволочные, сывороточные) для взятия материала из зева и носо­глотки.

2. Мазки для микроскопии.

2.1. Neisseria meningitidis — мазки из чистой культуры и спинномозговой жидкости, окраска по методу Грама и метиленовым синим.

2.2. Bordetella pertussis — мазок из чистой культуры, ок­раска по методу Грама.

2.3. Corynebacterium diphtheriae:

1) мазок из чистой культуры, окраска по методу Грама, метиленовым синим по Леффлеру, по Нейссеру;

2) мазок из чистой культуры в люминесцентном микроскопе, окраска корифосфином.

3. Культура N.meningitidis на сывороточном агаре.

4. Обнаружение менингококкового антигена в спинно­мозговой жидкости в РНГА.

5. Колонии B.pertussis на казеиноугольном агаре (КУА) и среде Борде—Жангу.

6. Определение уреазной активности возбудителя пара-коклюша.

7. РСК для серодиагностики коклюша.

8. Экспресс-диагностика коклюша с помощью имму-нофлюоресцентного метода.

9. Рост коринебактерий на свернутой сыворотке и тел-луритовой среде.

10. "Пестрые" ряды культур коринебактерий. Пробы на цистиназу и уреазу.

11. Определение токсигенности C.diphtheriae (реакция преципитации в агаре).

12. Ускоренный метод диагностики дифтерии.

▲ Задание студентам

1. Указать приспособления (виды тампонов) для взятия материала при менингококковой инфекции, коклюше и дифтерии.

2. Микробиологическое исследование при менингокок­ковой инфекции:

1) указать материал, подлежащий исследованию;

2) бактериоскопический метод: микроскопировать го-

товые мазки из спинномозговой жидкости и носо­глотки, сделать заключение;

3) бактериологическое исследование и иммунохими-ческий метод;

4) по результатам, полученным из лаборатории, сде­лать заключение.

3. Микробиологическое исследование при коклюше и
паракоклюше:

1) указать материал, подлежащий исследованию;

2) бактериоскопический метод: микроскопировать го­товые мазки из носоглотки. Сделать вывод и наме­тить план дальнейшего исследования;

3) бактериологический метод: по результатам, полу­ченным из лаборатории, сделать заключение.

4. Микробиологическое исследование при дифтерии:

1) указать материал, подлежащий исследованию;

2) бактериоскопический метод: микроскопировать мазки из материала, взятого из зева лиц с подозре­нием на дифтерию или бактерионосительство, сде­лать предварительное заключение и наметить ход дальнейшего исследования для подтверждения бак-териоскопического диагноза;

3) бактериологический метод: описать рост культуры, полученной на свернутой сыворотке, и колоний на теллуритовой среде, отметить результаты готовых посевов исследуемых культур на средах "пестрого" ряда, в случае обнаружения C.diphtheriae определить ее токсигенность. Сопоставить данные бактерио-скопического и бактериологического исследований с целью идентификации выделенной культуры и поставить окончательный микробиологический диагноз.

5. Дать краткую характеристику диагностическим, про­
филактическим и лечебным препаратам.

▲ Методические указания

• Микробиологическая диагностика менингококковой инфек­ции

МАТЕРИАЛ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ: спинномозговая жидкость, кровь, мазки со слизистой оболочки верхних отделов носоглотки, аспират из высыпных элементов.

При обследовании на носительство материал из верхних отделов носоглотки берут специальным носоглоточным тампо­ном (который на ³/4 Длины сгибают под углом 45°). При доставке в лабораторию его предохраняют от охлаждения и высушивания, поскольку менингококк очень чувствителен к воздействию этих факторов.

Спинномозговую жидкость берут в количестве 2—5 мл и делят на две части: одну центрифугируют и исследуют осадок, к другой добавляют полужидкую питательную среду и выдер­живают при 37 "С для накопления бактерий. Из исследуемого материала готовят мазки и производят посевы.

МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ:

Бактериоскопическое исследование (схема 14.2.1). Мазки из осадка спинномозговой жидкости окрашивают по методу Гра-ма и микроскопируют. При наличии гноя в большинстве слу­чаев обнаруживаются типичные грамотрицательные диплокок­ки, имеющие характерное расположение внутри лейкоцитов, что позволяет сделать окончательное заключение о менинго­кокковой инфекции. При микроскопии мазков из носоглотки бактерионосителей наряду с менингококком обнаруживаются грамположительные стафилококки и стрептококки, а также непатогенные нейссерии (Moraxella spp. и др.). Дифференциро­вать их по морфологическим признакам не представляется возможным.

Бактериологическое исследование. Исследуемый материал засевают петлей на чашки с питательным агаром, содержа­щим кровь, сыворотку крови или асцитическую жидкость. В среды добавляют антибиотик ристомицин (150 ЕД/мл), который задерживает размножение грамположительных кок­ков, содержащихся в исследуемом материале, и тем самым способствует выделению чистой культуры менингококка. Образование колоний менингококка на этих средах наблю­дается через 48 ч после инкубации посевов при 37 "С в атмосфере с повышенным содержанием С0₂ (3—10 %) и вы­сокой влажностью. В отличие от других кокков колонии ме­нингококка величиной с булавочную головку прозрачны, име­ют голубоватый оттенок и ровные края. Такие колонии пере­севают в пробирку со скошенным агаром для получения чистой культуры.

Идентификацию чистой культуры, дифференциацию от сап­рофитных нейссерии, обитающих в носоглотке, проводят по ряду культуральных и биохимических признаков. Так, менин­гококк растет только в присутствии нативного белка, в то время как другие нейссерии размножаются на простых средах и образуют пигмент; на средах Гисса с добавлением сыворотки крови менингококк ферментирует глюкозу и мальтозу до кис­лоты (табл. 14.2.1).

Экспресс-методы диагностики: иммунохимические, биохими­ческие и молекулярно-биологические исследования. Иммуно­химические исследования. Для выявления антигенов менингококков в мазках из исследуемого материала использу­ют метод ИФ.

Таблица 14.2.1. Дифференциальные признаки некоторых видов Neis­seria и Moraxella catarrhalis

N.gonor-rhoeae

M. catar­rhalis

N.men­ingitidis

N.sub-flava

N.mu-cosa

Признак

+	+	+	+	+
+	+	+	+	+
±	±	+	+	+
±	±	+	+	+
+	+	+	+	+

Продукция каталазы

Продукция оксидазы

Образование пигмента

Рост при 22 °С

Потребность для роста в сыворотке или крови

Образование кислоты при расщеплении углеводов:

+	+	+	+	±
+	±	±	[+]	±
+	±	+	±	±
±	±	+	±	±
±	±	+	+	±

глюкозы лактозы мальтозы сахарозы

Восстановление нитратов

Условные обозначения: (+) — 85—100 % штаммов положитель­ны; (±) — 16—84 % штаммов положительны; [+] — положительная замед­ленная реакция.

Для обнаружения в спинномозговой жидкости специфичес­кого полисахаридного менингококкового антигена применяют метод встречного иммуноэлектрофореза: в агаровых пластин­ках на стекле размером 9x12 см вырезают два параллельных ряда лунок диаметром около 3 мм. В лунки одного ряда вносят исследуемую жидкость, в лунки другого ряда — преципитирую-щие антименингококковые сыворотки разных серогрупп. Для реакции используют веронал-мединаловый буфер. Пластинки помещают в аппарат для иммуноэлектрофореза на 40—45 мин при комнатной температуре и силе тока около 30 А. При положительном результате между лунками со спинномозговой жидкостью и соответствующей антисывороткой образуются 1— 2 полосы преципитации.

Антигены возбудителя также могут быть обнаружены в ма­териале от больного в реакциях непрямой латекс-агглютина­ции, РИГА и др.

Биохимические и молекулярно-биологические исследования. Исследуемый материал, полученный из очага инфекции, используют для обнаружения ДНК возбудителя с помощью ПЦР. В случае обнаружения соответствующих моле­кул можно поставить предварительный диагноз.

Серодиагностика. Для ретроспективного подтверждения диа­гноза используют РИГА с парными сыворотками.

• Микробиологическая диагностика коклюша и паракоклюша

МАТЕРИАЛ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ: мокрота, слизь из носоглотки. Материал берут стерильным ватным тампоном из носоглотки больного ребенка. Для взятия материала у малень­ких детей тампон, приготовленный на тонкой эластичной про­волоке, вводят через нос.

МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ:

Бактериоскопическое исследование (схема 14.2.2). Бактерио-скопический метод как таковой при диагностике коклюша не применяется. Для быстрого обнаружения и идентификации Bordetella pertussis используют иммунофлюоресцентный метод (см. ниже).

Бактериологическое исследование. Основной метод лабора­торной диагностики коклюша. Материал для посева берут с помощью носоглоточного тампона или методом "кашлевых пластинок". Для этого в момент появления кашля открытую чашку Петри с питательной средой подносят ко рту ребенка и держат в течение 6—8 кашлевых толчков. Правильное и раннее взятие материала позволяет выделить возбудителя в начальном периоде болезни от 80—90 % больных. Материал засевают на КУА или кровяные среды — картофельно-глицериновый кро­вяной агар (среда Борде—Жангу) и молочно-кровяной агар. В питательные среды добавляют пенициллин для угнетения роста посторонней микрофлоры. Колонии B.pertussis на указан­ных средах обычно появляются через 48—72 ч культивирова­ния. В.parapertussis — несколько раньше: через 24—72 ч. Борде-теллы образуют мелкие (диаметром около 1 мм) выпуклые влажные блестящие колонии. На КУА колонии имеют серова­то-кремовый цвет, а на среде Борде—Жангу приобретают жем­чужный или ртутный блеск. Колонии В.parapertussis более круп­ные. На среде Борде—Жангу и молочно-кровяном агаре они образуют ограниченную зону гемолиза. Из колоний, выросших на чашках, готовят мазки, окрашивают их по методу Грама и микроскопируют. При наличии в мазках овоидных грамотри-цательных палочек ставят ориентировочную реакцию агглюти­нации с коклюшной и паракоклюшной сыворотками. Затем подозрительные колонии пересевают в пробирки для дальней­шего изучения чистых культур.

Идентификацию выделенной культуры производят на осно­вании комплексного изучения морфологических, культураль-ных, биохимических и серологических свойств (табл. 14.2.2). В отличие от других бордетелл B.pertussis не растет на простом питательном агаре и не изменяет цвета специальных питатель­ных сред.

Таблица 14.2.2. Дифференциальные признаки Bordetella spp.

Признак

В. per­tussis

В. parapertussis

В. bron- chisep- tica

Рост:

на агаре (простом) — + +

— Коричневая

окраска
на агаре с тирозином + +

Ярко-коричневая окраска Изменение окраски:

КУА — Буро-коричневая —

кровяного агара — Потемнение —

Образование уреазы + + +

Наличие антигенов:

родового (общего) 7 7 7

видового (специфического) 1 14 12

Условные обозначения: (+) — наличие признака; (—) — отсутст­вие признака; цифрами обозначены номера антигенов.

Для определения уреазы в агглютинационные пробирки вносят 0,3 мл 2 % раствора мочевины, 0,3 мл густой суспензии испытуемой культуры и 2—3 капли 0,1 % спиртового раствора фенолфталеина. В положительном случае через 20—30 мин появляется малиновое окрашивание, указывающее на расщеп­ление мочевины уреазой.

Серологическую идентификацию бордетелл, дифференциа­цию видов и определение сероваров (серотипирование) прово­дят в реакции агглютинации с адсорбированными факторными сыворотками. При этом исходят из того, что антиген (фактор) 7 является родовым, а антиген (фактор) 1 присущ только В.рег-tussis, 14 — В.parapertussis и 12 — B.bronchiseptica.

При бактериологической диагностике коклюша может воз­никнуть необходимость дифференциации бордетелл от Haemo­philus influenzae. H.influenzae часто встречается на слизистой оболочке дыхательных путей и вызывает пневмонии и другие воспалительные заболевания дыхательных путей. В отличие от бордетелл H.influenzae растет только на кровяных питательных средах — кровяном агаре, "шоколадном" агаре Левинталя, со­держащих гемин и коэнзим дегидрогеназы. Бактериологичес­кое исследование продолжается не менее 5 дней.

Экспресс-методы диагностики: иммунохимические, биохими­ческие и молекулярно-биологические исследования. Иммуно­химические исследования. Метод ИФ: тампоном делают два мазка, высушивают их на воздухе и фиксируют на пламени. Один мазок обрабатывают флюоресцирующими противокок-

люшными антителами, другой — паракоклюшными антитела­ми. Препараты микроскопируют в люминесцентном микроско­пе, просматривая не менее 50 полей зрения. О положительном результате свидетельствует обнаружение темных бактериаль­ных клеток с четким светящимся венчиком.

Биохимические и молекулярно-биологические исследования. Исследуемый материал, полученный из очага инфекции, используют для обнаружения ДНК возбудителя с помощью ПЦР. В случае обнаружения соответствующих моле­кул можно поставить предварительный диагноз.

Серодиагностика. Реакции агглютинации и РСК применяют в основном для ретроспективного подтверждения диагноза и дифференциальной диагностики атипичных форм коклюша. Агглютинины в крови больных появляются на 3—4-й неделе заболевания в титрах 1:20 и выше. В условиях массовой вак­цинации детей против коклюша диагностическое значение имеет нарастание титра антител в динамике болезни, поэтому реакцию ставят повторно через 4—5 дней.

• Микробиологическая диагностика дифтерии

МАТЕРИАЛ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ: мазки со слизистой оболочки зева и носа, пленки с поверхности миндалин и но­соглотки. Материал берут двумя ватными стерильными тампо­нами, один из которых используют для приготовления мазков, другой — для посева.

МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ:

Бактериоскопическое исследование (схема 14.2.3). Мазки ок­рашивают по методу Грама, метиленовым синим по Леффлеру, по Нейссеру. Для Corynebacterium diphtheriae характерно нали­чие полярно расположенных зерен волютина и расположение в виде буквы "V" (см. рис. 2.2.4). Corynebacterium pseudodiphth-eriae и дифтероиды не имеют зерен волютина или содержат их не на концах, а по длине палочки. Кроме того, сами бактерии располагаются в виде частокола. Применение люминесцентной микроскопии позволяет повысить эффективность исследова­ния. При этом C.diphtheriae можно отличить от других корине-бактерий по коричнево-красному свечению зерен волютина, которое они приобретают после окраски флюорохромом кори-фосфином. Цитоплазма этих бактерий дает зеленое или желтое свечение. Однако C.diphtheriae часто изменяют свою морфоло­гию, в частности при санации зева антибиотиками. В настоя­щее время бактериоскопическое исследование при дифтерии практически не используют в связи с его низкой надежностью (высокой частотой ложноположительных и ложноотрицатель-ных результатов).

Бактериологическое исследование. Является ведущим мето-

дом диагностики дифтерии. Материал засевают на кровяной агар и элективные питательные среды, содержащие теллурит: среда Клауберга (питательный агар с теллуритом натрия, гли­церином и дефибринированной кровью) и др. На средах с теллуритом задерживается рост кокков и другой микрофлоры зева, что способствует размножению возбудителя дифтерии. На теллуритовой среде C.diphtheriae образует черные колонии (рис. 14.2.1; на вклейке) за счет восстановления теллурита (биовар gravis формирует колонии серовато-черного цвета с радиальной исчерченностью поверхности, напоминающие цве­ток маргаритки, биовар mitis — круглые выпуклые колонии черного цвета). Типичные колонии, представленные грамполо-жительными палочками булавовидной формы с характерным расположением, содержащими зерна волютина, пересевают на кровяной агар для получения чистой культуры.

Для подтверждения диагноза дифтерии в первую очередь необходимо установить токсигенность выделенной культуры (способность к продукции дифтерийного токсина). Наличие токсина определяют с помощью различных серологических реакций (преципитации в агаре, ИФА и др.). Применяют также метод ПЦР, позволяющий обнаружить присутствие у выделен­ных бактерий fox-гена, контролирующего синтез дифтерийного токсина. До последнего времени общепринятым методом оп­ределения токсигенности являлась реакция преципитации в агаре с антитоксической противодифтерийной сывороткой. Методы ИФА и ПЦР, разработанные в последние годы, явля­ются более чувствительными и позволяют получить результат в течение 3—5 ч.

Определение токсигенности в реакции преципитации: в чашку Петри с питательным агаром, содержащим 15—20 % лошадиной сыворотки, 0,3 % мальтозы и 0,03 % цистина, кладут полоску фильтровальной бумаги, пропитанную анти­токсической противодифтерийной сывороткой, содержащей 5000 АЕ/мл. Чашку подсушивают при 37 °С в течение 30 мин и засевают исследуемые культуры в виде перпендикулярных к бумаге штрихов на расстоянии 0,6—0,8 см от края бумаги. В качестве контроля используют заведомо токсигенную куль­туру. Посевы инкубируют при 37 "С до следующего дня. При размножении токсигенной культуры в месте соединения ток­сина с антитоксическими антителами в плотной питательной среде образуется преципитат в виде белых линий — "усов" (см. рис. 10.1.7).

Выделенную культуру идентифицируют и дифференцируют от сходных с ней непатогенных коринебактерий по морфоло­гическим особенностям, культуральным и биохимическим признакам: пробы на цистиназу, уреазу, ферментация углево­дов и др. (табл. 14.2.3). В случае выделения нетоксигенной культуры ставят дополнительную реакцию агглютинации с

Таблица 14.2.3. Биологические свойства коринебактерий

C.diphtheriae биовар grav/s + биовар mitts + C.xerosis ± C.pseudodiphtheriticum ±

__ + + + + _ +

+ — + — + + — + — + + — — ±— —

Условные обозначения: (+) — 85—100 % штаммов положитель­ны, (±) — 16—84 % штаммов положительны; (—) — отсутствие признака.

противодифтерийной сывороткой с целью выявления видоспе-цифического антигена С. diphtheriae.

Для определения цистиназы (проба Пизу) в столбик питательного агара с цистином уколом засевают исследуемую культуру. Посевы инкубируют при 37 "С до следующего дня. C.diphtheriae вызывают почернение среды по ходу посева (в ре­зультате образования сульфида свинца), вокруг которого появ­ляется зона коричневого цвета, а на глубине 1 см от поверх­ности агара в среде образуется коричневое "облачко".

Для определения уреазы (проба Закса) готовят спирто­вой раствор мочевины и раствор индикатора — фенолового красного, которые перед употреблением смешивают в соотно­шении 1:9 и разливают по 1—2 мл в агглютинационные про­бирки. Затем исследуемые бактерии петлей вносят и растирают по стенке пробирки. После 20—30-минутной инкубации при 37 "С наблюдают расщепление мочевины уреазой, в результате чего среда приобретает красный цвет.

Экспресс-методы диагностики: иммунохимические, биохими­ческие и молекулярно-биологические исследования. Биохими­ческие и молекулярно-биологические исследова­ния. Исследуемый материал, полученный из очага инфекции, используют для обнаружения tax-гена C.diphtheriae с помощью ПЦР. В случае обнаружения соответствующих молекул можно поставить предварительный диагноз.

• Диагностические, профилактические и лечебные препараты

Преципитирующие антименингококковые сыворотки. Приме­няют с диагностической целью для обнаружения менингокок-кового антигена в спинномозговой жидкости (методом встреч­ного иммуноэлектрофореза).