А Методические указания. • Микробиологическая диагностика инфекций, вызванных энтеровирусами (полиовирусы, вирусы Коксаки и ECHO)

• Микробиологическая диагностика инфекций, вызванных энтеровирусами (полиовирусы, вирусы Коксаки и ECHO)

МАТЕРИАЛ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ: смывы из зева (пер­вые дни болезни), фекалии; спинномозговая жидкость (при менингите).

МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ:

Вирусологическое исследование. Является ведущим методом диагностики энтеровирусных инфекций. Выделение энтерови-русов (за исключением вирусов Коксаки типа А) из исследуе­мого материала осуществляют путем заражения клеточных культур. Для уничтожения сопутствующей бактериальной мик­рофлоры нестерильный материал (испражнения, глоточные смывы) предварительно обрабатывают антибиотиками (смесь пенициллина со стрептомицином, содержащая по 1000 ЕД/мл каждого антибиотика в растворе Хенкса) в течение суток при 4 °С, после чего проводят контрольный посев на стерильность. При сохранении бактериальной флоры материал повторно об­рабатывают теми же антибиотиками. Затем одновременно за­ражают по 2—3 пробирки с первичной (эмбриональные фиб-робласты человека или клетки почек обезьян) и перевиваемой культурой клеток (HeLa, амниона человека или др.), поскольку одни серотипы энтеровирусов лучше репродуцируются в пер­вичных, другие — в перевиваемых клетках.

Индикацию вирусов проводят по ЦПД: на 2—3-й день ин­кубации при 35 °С наблюдается полная или частичная дегене­рация клеток. При этом интенсивность ЦПД зависит от дозы вируса, типа культуры клеток и других причин. В случае от­сутствия ЦПД проводят дополнительно 2—3 пассажа. Основ­ным методом идентификации выделенного вируса является серотипирование в реакции нейтрализации (табл. 19.1.1; 19.1.2; 19.1.3). С этой целью материал из чистой культуры выделен­ного вируса обрабатывают смесью диагностических монова­лентных сывороток к различным серотипам энтеровирусов. При нейтрализации вируса в последующих пересевах ЦПД исчезает. Затем проводят реакцию нейтрализации с монова­лентными сыворотками. При этом в начале определяют тип вируса (полиовирус, Коксаки или ECHO), а затем его принад­лежность к определенному серотипу.

Таблица 19.1.1. Результаты реакции нейтрализации выделенных от больных вирусов с моновалентными иммунными сыворотками к вирусам полиомиелита I—III типов

Сыворотка к вирусам полиомие-	Наличие ЦПД			Тип выде­ленного вируса
исследуемый материал		конт­роль сыво-
	2-й	3-й	4-й	5-й	6-й	7-й	миелита
	день	день	день	день	день	день	ротки
I II — — + +++ ++++	++++		I
III — — ++ +++ ++++	++++	—
Контроль — + ++ +++ ++++	++++
вируса

Условные обозначения: (++++) —выраженная дегенерация кле­ток с их отслаиванием от стенок пробирки; (+++) — менее выраженная дегенерация клеток с частичным отслаиванием от стенок пробирки; (+.+) — наличие не более 50 % дегенерированных клеток; (+) — наличие одиночных дегенерированных клеток; (—) — отсутствие ЦПД.

Таблица 19.1.2. Результаты реакции нейтрализации вьщеленных от больных вирусов с моновалентными иммунными сыворотками к вирусам Коксаки

Сыворот-			Наличие ЦПД			Тип
сам Кок­саки		исследуемый материал		конт­роль сыво­ротки	го вируса Коксаки
2-й день	3-й день	4-й день	5-й день	6-й день	7-й день
В-1	—	+ +	+++	++++	++++	—
В-2	—	++ +++	+++	++++	++++	—
В-3	—	— —	—	—	—	—	Коксаки В-3
В-4	—	+ + +	+++	++++	+++ +	__
В-5	—	++ + +	+++	++++	+ + + +	—
В-6	—	+ ++	+++	++++	++ + +	—
Контроль вируса	—	++ +-Н-	+++	++++	+++ +	—

Условные обозначения: те же, что и в табл. 19.1.1.

Некоторые энтеровирусы (вирусы ECHO серотипов 3, 6, 7; Коксаки А серотипов 20 и 21; Коксаки В серотипов 1 и 5) обладают гемагглютинирующими свойствами. Их идентифици­руют в РТГА. Для идентификации применяют и другие методы (ИФ, ИФА, метод ДНК-зондов и др.).

Необходимо помнить, что положительный результат виру­сологического исследования имеет абсолютную диагностичес­кую ценность только в случае выделения вируса из стерильного материала (спинномозговая жидкость, кровь, биоптаты орга­нов), поскольку бессимптомное носительство широко распро­странено (до 50 % здорового населения). При обнаружении вируса в испражнениях или глоточных смывах необходимо серологическое подтверждение диагноза.

Биопроба. Для выделения вирусов Коксаки А, которые пло­хо репродуцируются в культурах клеток, применяют биопробу — исследуемым материалом заражают новорожденных белых мы­шей. В положительном случае у зараженных животных на 3—5-й день развиваются вялые параличи. Идентификацию этих вирусов проводят в РН на новорожденных мышах с мо­новалентными диагностическими сыворотками против различ­ных серотипов вирусов Коксаки А.

Экспресс-методы диагностики. Молекулярно-биологи-ческие исследования. РНК вирусов в исследуемом мате­риале обнаруживают методом гибридизации НК (ДНК-зондов).

Серодиагностика. С диагностической целью в крови больных определяют наличие специфических противовирусных имму­ноглобулинов класса М (IgM) с помощью ИФА. Для ретроспек­тивного подтверждения диагноза применяют также метод парных сывороток. С этой целью кровь у больного берут дважды: в первые дни болезни и через 3—4 нед. Раннюю сыворотку сохра­няют в холодильнике и реакцию ставят одновременно с обеими сыворотками. Антитела определяют в реакции нейтрализации в культуре клеток с эталонными штаммами энтеровирусов, при­надлежащих к тем серотипам, которые чаще всего выделяют от больных (табл. 19.1.4). Для серодиагностики заболеваний, вы­званных гемагглютинирующими вирусами Коксаки, используют РТГА. Диагностическое значение имеет нарастание титра антител в поздней сыворотке не менее чем в 4 раза. При обнаружении антител, соответствующих серотипу выделенного вируса, диагноз считается подтвержденным.

• Микробиологическая диагностика весенне-летнего клещево­го энцефалита

МАТЕРИАЛ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ: кровь.

МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ:

Серодиагностика. Обнаружение противовирусных антител в крови больного является основным методом диагностики кле­щевого энцефалита, поскольку к моменту появления симптомов заболевания период вирусемии заканчивается. Выделение вируса из спинномозговой жидкости редко бывает успешным. Для се­родиагностики применяют метод парных сывороток. Используют РН, РСК, РТГА, реакцию латекс-агглютинации, ИФА и другие

реакции со стандартными вирусными антигенами. Диагности­ческое значение имеет нарастание титра специфических анти­тел не менее чем в 4 раза. Оценку результатов производят с учетом анамнестических данных: вакцинация, пассивная им­мунизация (введение противоэнцефалитной сыворотки или иммуноглобулина).

Экспресс-методы диагностики: иммунохимические и молеку-лярно-биологические исследования. Иммунохимические ис­следования. С целью экспресс-диагностики клещевого энце­фалита применяют методы определения зараженности клеща, извлеченного из места укуса. Основным методом является ИФ. Готовят мазки-отпечатки и обрабатывают флюоресцирующими антителами к антигенам вируса клещевого энцефалита. В по­ложительном случае наблюдается специфическое свечение скоплений вирусных антигенов внутри клеток, присутствую­щих в материале. Наличие антигенов вируса в организме клеща можно определить и с помощью других иммунологических методов (РНГА со взвесью исследуемого материала и эритро­цитами, нагруженными антителами к вирусу клещевого энце­фалита, ИФА и др.). Предварительный ответ получают спустя 2-3 ч.

• Микробиологическая диагностика энцефалитов, вызывае­
мых другими арбовирусами и аренавирусами

МАТЕРИАЛ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ: кровь.

МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ:

Лабораторная диагностика энцефалитов, вызываемых арбо­вирусами и аренавирусами, осуществляется аналогично диа­гностике весенне-летнего клещевого энцефалита. Необходимо помнить, что наличие сходных групповых антигенов у арбови-русов во многих случаях не позволяет установить, какой имен­но возбудитель из группы родственных вирусов явился причи­ной заболевания.

• Микробиологическая диагностика бешенства

МАТЕРИАЛ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ: слюна животного, явившегося источником заражения; соскобы с роговицы глаза, биоптаты кожи (затылочной области), кровь, спинномозговая жидкость (при необходимости подтверждения клинического диагноза); биоптаты мозга (для постмортальной диагностики).

МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ:

Гистологическое исследование. При постмортальной диаг­ностике бешенства проводят морфологическое исследование сре­зов головного мозга (области гиппокампа и мозжечка), окрашен­ных метиленовым синим и эозином. В 70—90 % случаев в зара­женных нейронах удается обнаружить признаки характерного

ЦПД вируса бешенства — присутствие внутрицитоплазматичес-ких включений — телец Бабеша—Негри (рис. 19.1.1; на вклейке). Тельца окрашиваются в фиолетово-красный цвет, имеют ок­руглую или овальную, реже неправильную форму, диаметр 4—10 мкм.

Вирусологическое исследование и биопроба. Слюну подозри­тельного животного вводят интрацеребрально новорожденным белым мышам. Реже для выделения вируса из слюны применяют клеточные культуры (линии VERO, диплоидные клетки человека и др.). Присутствие вируса в биоптатах мозга зараженных мышат или клетках культуры определяют по наличию его антигенов с помощью метода ИФ. Для этого срезы мозга или клетки зара­женной культуры обрабатывают флюоресцирующими противо­вирусными антителами. В положительном случае при люми­несцентной микроскопии препаратов наблюдается специфи­ческое свечение в цитоплазме зараженных клеток.

Экспресс-методы диагностики: иммунохимические, биохими­ческие и молекулярно-биологические исследования. Иммуно­химические исследования. Присутствие антигенов виру­са в соскобах с роговицы глаза, биоптатах кожи или биоптатах мозга (при постмортальной диагностике) выявляют методом ИФ (см. выше). Необходимо помнить, что тесты становятся положительными только на поздних стадиях заболевания и применяются исключительно с целью подтверждения клини­ческого диагноза.

Молекулярно-биологические исследования. Ви­русные НК в исследуемом материале обнаруживают с помо­щью ПЦР или метода зондов.

Серодиагностика. Наличие противовирусных антител в кро­ви и спинномозговой жидкости пациента определяют методом непрямой ИФ и в РН (в культуре клеток или на белых мышах). Серодиагностика, как и другие существующие методы лабора­торной диагностики бешенства, не позволяет своевременно установить диагноз, поскольку антитела в организме больного появляются только на поздних стадиях заболевания.

• Микробиологическая диагностика поражений ЦНС при ви­русном паротите

МАТЕРИАЛ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ: спинномозговая жидкость (собирают в стерильный контейнер и сохраняют при +4 °С не более 48 ч). При необходимости более длительного хранения материал замораживают и хранят при —70 "С.

МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ:

Вирусологическое исследование. Выделение чистой культуры вируса из спинномозговой жидкости является ведущим мето­дом диагностики поражений ЦНС при вирусном паротите (см. главу 21).

Экспресс-методы диагностики: иммунохимические, биохими­ческие и молекулярно-биологические исследования. Иммунохи­мические исследования. Методы обнаружения антигенов возбудителя в исследуемом материале — см. главу 21.

Молекулярно-биологические исследования. Вирус­ные НК в исследуемом материале обнаруживают с помощью ПЦР или метода ДНК-зондов.

• Микробиологическая диагностика поражений ЦНС, вызван­ных вирусом кори

МАТЕРИАЛ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ: спинномозговая жид­кость, биоптат тканей ЦНС.

МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ:

Цитологическое исследование. Спинномозговую жидкость центрифугируют, из осадка, содержащего слущенные клетки, готовят мазки. Мазки или препараты тканей головного мозга окрашивают по методу Романовского—Гимзы. В положитель­ном случае удается обнаружить признаки ЦПД — гигантские многоядерные клетки, часто содержащие внутрицитоплазмати-ческие включения. В поздних стадиях заболевания, а также при хронических формах инфекции (в частности, подостром скле-розирующем панэнцефалите — ПСПЭ) типично появление внутриядерных включений. Метод обладает низкой чувстви­тельностью и специфичностью.

Вирусологическое исследование. Вирус кори с трудом удается культивировать in vitro, поэтому выделение чистой культуры возбудителя из исследуемого материала редко применяют с диагностической целью (см. главу 21). Другой причиной явля­ется низкое содержание вируса в спинномозговой жидкости. Необходимо помнить, что при ПСПЭ в организме персисти-рует дефектный вирус, который не удается культивировать с помощью стандартных методов. В этом случае применяют ме­тод совместного культивирования клеток ткани мозга или пе­риферической крови пациента с культурой клеток, чувстви­тельных к вирусу. Исследование занимает не менее 1 мес. Присутствие вируса определяют по ЦПД и путем выявления его антигенов методом ИФ.

Экспресс-методы диагностики: иммунохимические и молеку­лярно-биологические исследования. Иммунохимические исследования. Присутствие антигенов вируса в клетках био-птата мозга и слущенных клетках спинномозговой жидкости выявляют методом ИФ (см. главу 21). Необходимо иметь в виду, что отрицательный результат исследования не исключает заболевания, что объясняется малым содержанием вируса в клетках спинномозговой жидкости и сравнительно низкой чув­ствительностью метода. Присутствие вирусных белков (анти-

генов) в исследуемом материале может быть выявлено с помо­щью чувствительных серологических реакций: ИФА, РИА и др.

Молекулярно-биологические исследования. Ви­русные НК в исследуемом материале обнаруживают с помо­щью ПЦР или метода ДНК-зондов.

Серодиагностика. Обнаружение специфических противови­русных антител в спинномозговой жидкости является ведущим методом диагностики поражений ЦНС, вызываемых вирусом кори. Повышенное содержание противокоревых антител в спинномозговой жидкости является характерным для всех форм патологии ЦНС, обусловленных этим вирусом. Наличие противокоревых антител в спинномозговой жидкости опреде­ляют с помощью различных серологических реакций (см. главу 21). Методы ИФА и непрямой ИФ являются наиболее чувст­вительными и дают положительный результат в большинстве случаев.

• Микробиологическая диагностика поражений ЦНС, вызван­
ных вирусом краснухи

МАТЕРИАЛ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ: спинномозговая жидкость.

МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ:

Серодиагностика. Обнаружение специфических противови­русных антител в спинномозговой жидкости является ведущим методом диагностики поражений ЦНС, вызываемых вирусом краснухи (см. главу 21).

• Микробиологическая диагностика инфекций, вызванных
HTLV-1

МАТЕРИАЛ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ: кровь.

МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ:

Серодиагностика. Обнаружение противовирусных антител в крови пациента с помощью ИФА применяют в качестве ос­новного метода лабораторной диагностики тропического спас­тического паралича. В случае положительного результата с целью верификации осуществляют поиск антител к индивиду­альным вирусным белкам методом иммуноблоттинга.

• Микробиологическая диагностика инфекций ЦНС, вызван­
ных герпесвирусами (вирусы простого герпеса 1 и 2-го типа
(HSV-l, HSV-2), вирус ветряной оспы/опоясывающего
лишая (VZV), цитомегаловирус человека (CMV), вирус
Эпштейна—Барр (ЕВУ).

МАТЕРИАЛ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ: спинномозговая жидкость.

МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ: см. главу 21.

Необходимо помнить, что при герпетическом энцефалите выделение вируса из спинномозговой жидкости не всегда бы­вает успешным. В этом случае диагноз ставят на основании обнаружения вирусных антигенов, нуклеиновых кислот и фер­ментов, а также высоких титров противовирусных антител в спинномозговой жидкости.

• Микробиологическая диагностика инфекций ЦНС,
вызванных JCV

МАТЕРИАЛ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ: биоптат из поражен­ного участка головного мозга.

МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ:

Цитологическое исследование. Основано на обнаружении из­мененных клеток с признаками ЦПД (увеличение клеток, на­личие одиночных базофильных внутриядерных включений) в биоптатах головного мозга.

Вирусоскопическое исследование. Метод электронной мик­роскопии позволяет обнаружить зрелые вирусные частицы в клетках пораженных участков головного мозга.

Экспресс-методы диагностики: иммунохимические и молеку-лярно-биологические исследования. Иммунохимические ис­следования. Обнаружение вирусных антигенов в клетках пора­женных участков головного мозга осуществляют методом ИФ.

Молекулярно-биологические исследования. Обнару­жение вирусных ДНК в зараженных клетках осуществляют методом ДНК-зондов (ДНК-гибридизация in situ), ПНР.

Серодиагностика — обнаружение антител к вирусным бел­кам — не информативна, поскольку антитела присутствуют также у здоровых вирусоносителей.

• Микробиологическая диагностика инфекций ЦНС,
вызванных прионами

Общепринятые методы лабораторной диагностики отсутст­вуют. Диагноз устанавливают преимущественно на основании клинической картины заболевания и подтверждают гистологи­ческим исследованием тканей пораженных участков головного мозга. Наблюдается дегенерация нейронов и аксонов серого вещества головного мозга, накопление амилоидоподобного ве­щества, образующего бляшки и фибриллярные скопления внутри и вне нейронов, гипертрофия глиальных клеток и дру­гие изменения, характерные для спонгилоформной энцефало­патии. В последние годы разработаны методы иммунохимичес-кого обнаружения аномальной формы приона (РгР^^с) в клетках головного мозга методом ИФ. Метод также позволяет проде­монстрировать накопление PrP^Sc в клетках роговицы глаза на ранних стадиях болезни.

• Диагностические, профилактические и лечебные препараты

Диагностические поливалентная и типоспецифические полио-миелитные сыворотки. Применяют для идентификации и типи-рования вирусов полиомиелита.

Диагностические поливалентные и типоспецифические (моно­валентные) сыворотки к вирусам Коксаки и ECHO. Применяют для идентификации и типирования соответствующих вирусов.

Пероральная живая вакцина против полиомиелита (трехва­лентная). Содержит ослабленные штаммы вирусов полиомие­лита I—III типов. Вакцина выпускается в жидком виде и в форме драже. Применяют для профилактики полиомиелита (создание активного иммунитета).

Парентеральная инактивированная вакцина против полиомие­лита (трехвалентная). Содержит инактивированные вирусы по­лиомиелита I— III типов. Применяют для профилактики полио­миелита (создание активного иммунитета).

Диагностикум из вируса клещевого энцефалита. Используют для серодиагностики клещевого энцефалита.

Инактивированная культуральная вакцина против клещевого энцефалита. Стерильный специфический антиген вируса кле­щевого энцефалита, инактивированного формалином. Приме­няют для профилактики клещевого энцефалита по эпидеми­ческим показаниям (создание активного иммунитета).

Иммуноглобулин против клещевого энцефалита. Содержит противовирусные специфические антитела, получаемые из сы­воротки крови лошадей, гипериммунизированных вирусом клещевого энцефалита. Применяют для лечения и экстренной профилактики клещевого энцефалита (пассивный иммунитет).

Живая антирабическая вакцина Ферми. Изготавливают из мозга молодых овец, зараженных фиксированным (аттенуиро-ванный штамм) вирусом бешенства. Вирус в суспензии мозга обрабатывают 1 % раствором фенола и лиофилизируют. При­меняется для создания активного иммунитета с целью профи­лактики бешенства. Вакцину вводят лицам, укушенным подо­зрительными на бешенство животными. Поствакцинальный им­мунитет развивается через 2 нед и сохраняется в течение 6 мес.

Культуральная убитая антирабическая вакцина. Получают пу­тем химической инактивации вируса бешенства, выращенного в культуре клеток. Применяют для профилактики бешенства (создание активного иммунитета).

Антирабический иммуноглобулин. Получают путем гиперим­мунизации лошадей фиксированным вирусом бешенства. При­меняют для создания пассивного иммунитета с целью профилак­тики бешенства. Препарат вводят не позднее 72 ч после укуса животного в сочетании с антирабической вакциной. Препарат обезвреживает вирус бешенства и предупреждает развитие пост­вакцинальных энцефалитов.

жительный инкубационный период, а также способность к персистенции, что является причиной развития хронической инфекции. Обязательной мерой профилактики заражения ви­русным гепатитом при переливании крови является контроль доноров крови на носительство вирусов гепатита. Заболевания, протекающие с поражением печени — гепатитом — в качестве одного из проявлений генерализованной инфекции, способны вызывать также другие вирусы. Наиболее часто гепатит возни­кает при инфекциях, вызванных вирусом желтой лихорадки, герпесвирусами (CMV, HSV-l, HSV-2, EBV). Гепатит также может развиваться при тяжелых формах кори, паротита, крас­нухи, вирусных системных лихорадок. Лабораторная диагнос­тика этих инфекций описана в соответствующих главах.

Тема 20.1. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА КИШЕЧНЫХ ВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИЙ И ВИРУСНЫХ ГЕПАТИТОВ

▲ План

▲ Программа

1. Биологические свойства возбудителей кишечных ви­русных инфекций и вирусных гепатитов, их патоген-ность, экология, особенности инфекции и эпидемио­логия вызываемых заболеваний.

2. Микробиологическая диагностика.

3. Диагностические, профилактические и лечебные пре­параты.

А Демонстрация

1. Реакция преципитации в агаре (встречная диффузия в геле по Оухтерлони) для обнаружения HBs-антигена в сыворотке крови больного вирусным гепатитом В.

2. Диагностические, профилактические и лечебные пре­параты.

▲ Задание студентам

1. Указать материал для исследования.

2. Учесть результаты выявления специфических HBs-ан-тигенов в сыворотке крови больного с помощью РИГА.

3. Учесть результаты выявления специфических HBs-ан-тигенов в сыворотке крови донора с помощью имму-ноферментного метода.

4. Учесть результаты выявления анти-НВз-антител в сы­воротке крови больного с помощью РИГА. Оценить нарастание титра анти-ИВв-антител в динамике забо­левания.

5. Учесть результаты выявления в сыворотке больного IgM против вируса гепатита А.

6. Дать краткую характеристику демонстрируемым диа­гностическим, профилактическим и лечебным пре­паратам.

▲ Методические указания

• Микробиологическая диагностика кишечных вирусных ин­фекций

МАТЕРИАЛ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ: испражнения.

МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ:

Вирусоскопическое исследование. Является одним из веду­щих методов диагностики кишечных вирусных инфекций. Зре­лые вирионы в испражнениях можно обнаружить с помощью метода электронной микроскопии.

Вирусологическое исследование. Применяют исключительно с целью диагностики эпидемий и вспышек кишечных вирус­ных инфекций. Для выделения реовирусов и ротавирусов из испражнений используют различные типы клеточных культур (HeLa, первичные культуры клеток почек обезьян и др.). Ин­дикацию осуществляют по ЦПД, которое развивается в течение 3 нед и характеризуется появлением внутрицитоплазматичес-ких включений и неспецифической дегенерацией клеток. Ве­дущим методом идентификации и типирования является ана­лиз фрагментов вирусной РНК методом электрофореза. Выде­ление чистой культуры вирусов ECHO — см. главу 9. Кишеч­ные коронавирусы, калицивирусы, астровирусы и аденовирусы не удается культивировать in vitro.

Экспресс-методы диагностики: иммунохимические и молеку-лярно-биологические исследования. Иммунохимические ис­следования. Присутствие антигенов вирусов в испражнениях можно определить с помощью метода ИЭМ (антигены цельных вирионов) и чувствительных серологических реакций (латекс-агглютинации, ИФА, РИФ и др.).

Молекулярно-биологические исследования. Вирус­ные НК в испражнениях можно обнаружить с помощью ПЦР или метода ДНК-зондов.

Серодиагностика. Серодиагностика при кишечных вирусных инфекциях малоинформативна и применяется преимуществен­но с целью ретроспективной диагностики и для оценки эпи­демиологической ситуации. Для определения противовирусных антител в крови пациента применяют различные серологичес­кие реакции (РИГА, ИФА, РИА и др.). Ретроспективную диа­гностику осуществляют методом парных сывороток. Диагнос­тическое значение имеет нарастание титра антител в поздней сыворотке не менее чем в 4 раза. Выявление (методом ИФА) специфических противовирусных иммуноглобулинов класса М (IgM) свидетельствует об активной инфекции.

• Микробиологическая диагностика вирусного гепатита А

МАТЕРИАЛ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ: кровь, испражнения. МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ:

Вирусоскопическое исследование. Зрелые вирионы в испраж­нениях можно обнаружить с помощью метода электронной микроскопии.

Экспресс-методы диагностики: иммунохимические и молеку-лярно-биологические исследования. Иммунохимические исследования. Присутствие антигенов вируса в испражне­ниях можно определить с помощью метода ИЭМ (антигены цельных вирионов) и чувствительных серологических реакций ИФА, РИА и др. В типичных случаях вирус гепатита А удается обнаружить в фекалиях за 10—14 дней до появления клини­ческих признаков заболевания. Вирус продолжает выделяться с испражнениями в течение 2—3 нед после начала желтухи.

Молекулярно-биологические исследования. Вирус­ные нуклеиновые кислоты в крови пациента на ранних сроках болезни обнаруживают с помощью ПЦР или метода ДНК-зон­дов.

Серодиагностика. Является ведущим методом диагностики вирусного гепатита А. Для определения противовирусных ан­тител в крови пациента применяют различные серологические реакции (РИГА, ИФА, РИА и др.). Серодиагностику осущест­вляют методом парных сывороток (диагностическое значение имеет нарастание титра антител в поздней сыворотке не менее чем в 4 раза) или на основании выявления (методом ИФА) специфических противовирусных иммуноглобулинов класса М (IgM), свидетельствующих об активной инфекции. Последние присутствуют в сыворотке крови с первых дней заболевания и исчезают не ранее чем через 3—4 мес.

Для выявления IgM против вируса гепатита А используют различные варианты ИФА. Противовирусные IgM можно вы­явить следующим способом: на первом этапе на стенках лунок пластиковых планшетов адсорбируют антитела против челове­ческих IgM, на втором этапе в лунки вносят испытуемую сыворотку в различных разведениях. Фиксированные анти-IgM-антитела связывают все IgM сыворотки, в том числе и противовирусные антитела. Далее вносят стандартный антиген вируса гепатита А и меченые антитела против этого антигена. После инкубации и тщательного промывания буферным рас­твором с детергентами в лунки добавляют субстрат и хромоген. В положительном случае через несколько минут наблюдается появление окраски.

• Микробиологическая диагностика вирусного гепатита В

МАТЕРИАЛ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ: кровь, биоптат печени.

МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ:

Экспресс-методы диагностики: иммунохимические и молеку­лярно-биологические исследования. Иммунохимические исследования. Присутствие вирусспецифических антигенов в крови можно определить с помощью различных серологических реакций: иммунопреципитации в геле, РНГА, ИФА, РИА и др. На разных стадиях заболевания и при разных формах инфекции (острой, хронической, вирусоносительстве) в крови присутствуют разные антигены вируса (HBs, НВё), что используют с целью диагностики (табл. 20.1.1). Через 3—5 нед после заражения виру­сом гепатита В и за 4—5 нед до появления клинической картины в сыворотке крови больных обнаруживают поверхностный анти­ген вируса — Я&-антиген (австралийский антиген). Выявление ЯДу-антигена свидетельствует о текущей острой или хроничес­кой инфекции и является основным методом контроля крови доноров. Присутствие ЯЯе-антигена является ведущим марке­ром активной репродукции вируса.

Таблица 20.1.1. Определение антигенов (Аг) и антител (Ат) в крови при лабораторной диагностике вирусного гепатита В

Период болезни	HBs	НВс	HBe
	Аг	Ат	Ат	Аг	At
Инкубационный период	+	—	—	+	—
Продромальный период	+	—	± (IgM)	+	—
Острый период	+	—	+ (IgM)	+	—
Реконвалесценция: ранняя	—	—	+	—	±
поздняя	—	+	+ (IgG)	—	+
Хроническая активная форма	+	±	+ (IgG)	+	±
Хроническая бессимптомная	+	—	_	—	±
форма (носительство)

Наиболее простой и специфичный, но низкочувствитель­ный метод обнаружения Я&-антигена — реакция встречной иммунодиффузии в геле. Сыворотку крови больного вносят в периферические лунки агаровой пластинки, в центральную лунку вносят стандартную сыворотку акт-HBs, полученную от переболевших гепатитом В. Учет реакции производят через 48—72 ч по появлению дуг преципитации между лунками.

Наиболее простым из чувствительных методов выявления ЯЯу-антигена является РНГА. В этой реакции используют эритроцитарный антительный диагностикум, т.е. эритроциты, нагруженные гипериммунным анти-ЯА-иммуноглобулином. Чувствительность РНГА в 100 раз выше, чем реакции преци­питации в геле. К наиболее чувствительным реакциям отно­сится ИФА, основанный на принципе "сандвича". Первона-

чально на поверхности твердой фазы (полимера) адсорбируют анти- -антитела из стандартной сыворотки. Обычно исполь­зуют лунки микротитрационных панелей. На втором этапе в отмытые лунки вносят исследуемую сыворотку крови больного. При наличии -антигена он связывается фиксированными на твердой фазе антителами. На третьем этапе добавляют анти- -антитела, несущие ферментную метку. В качестве метки используют фермент пероксидазу. Для выявления связанных антигеном меченых антител в отмытые лунки добавляют суб­страт — пероксид водорода и хролюген — ортофенилендиамин, который окисляется в присутствии кислорода, выделяющегося при разложении пероксида водорода под воздействием фер­мента с образованием продуктов желто-коричневого цвета. Степень окраски отражает интенсивность связывания меченых антител, которая пропорциональна количеству -антигена в исследуемой сыворотке.

Реакции РНГА, ИФА, РИА и другие могут быть использованы и для выявления -антигена в исследуемой сыворотке.

В биоптатах печени при активной форме инфекции можно выявить наличие НВс-антигена, ассоциированного с гепатоци-тами, методом ИФ.

Молекулярно-биологические исследования. Ви­русные ДНК в крови пациента обнаруживают с помощью ПЦР или метода ДНК-зондов.

Серодиагностика. На разных стадиях заболевания и при раз­ных формах инфекции (острой, хронической, вирусоноситель-стве) в крови присутствуют антитела к разным антигенам ви­руса гепатита В (HBs, HBc, НВе), что используют с целью диагностики (см. табл. 20.1.1). Для определения антител при­меняют различные серологические реакции: РНГА, ИФА, РИА и др. (см. выше).

Так, для выявления анти- -антител в исследуемой сыво­ротке необходим соответствующий эритроцитный диагности-кум — эритроциты, нагруженные стандартным -антигеном. Реакцию, как правило, ставят с парными сыворотками. В тесте ИФА на поверхности твердой фазы адсорбируют стандартный -антиген, на втором этапе вносят исследуемую сыворотку в десятикратных разведениях, инкубируют, отмывают и добав­ляют меченую антиглобулиновую сыворотку.

Выявление антител к -антигену свидетельствует об ак­тивной инфекции и является одним из методов контроля крови доноров. Определение анти- IgM является ведущим мето­дом дифференциальной диагностики острого и хронического активного вирусного гепатита В.

• Микробиологическая диагностика вирусного гепатита С МАТЕРИАЛ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ: кровь.

МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ:

Экспресс-методы диагностики. Молекулярно-биологи­ческие исследования. Вирусную РНК в крови пациента обнаруживают с помощью ПЦР или методом ДНК-зондов.

Серодиагностика. Является ведущим методом диагностики хронического вирусного гепатита С и контроля крови доноров. Противовирусные антитела в крови пациентов определяют с помощью чувствительных серологических реакций (ИФА, РИА и др.) с рекомбинантным вирусным антигеном. Необходимо иметь в виду, что в остром периоде заболевания антитела в крови присутствуют в низком титре и часто в комплексе с антигеном, поэтому их выявление не всегда удается.

• Микробиологическая диагностика вирусного гепатита D
МАТЕРИАЛ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ: кровь.
МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ:

Экспресс-методы диагностики: иммунохимические и молеку­лярно-биологические исследования. Иммунохимические ис­следования. Присутствие дельта-антигена в крови можно определить с помощью чувствительных серологических реак­ций ИФА, РИА и др.

Молекулярно-биологические исследования. Вирус­ную НК в исследуемом материале обнаруживают с помощью ПЦР или метода ДНК-зондов.

Серодиагностика. Является ведущим методом диагностики вирусного гепатита D и контроля крови доноров. Антитела к дельта-антигену в крови пациентов определяют с помощью чувствительных серологических реакций (ИФА, РИА и др.).

• Микробиологическая диагностика вирусного гепатита G
МАТЕРИАЛ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ: кровь.
МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ:

Экспресс-методы диагностики: иммунохимические и молеку­лярно-биологические исследования:

Иммунохимические исследования. Присутствие анти­генов вируса гепатита G в крови можно определить с помощью чувствительных серологических реакций ИФА, РИА и др.

Молекулярно-биологические исследования. Вирус­ную НК в исследуемом материале обнаруживают с помощью ПЦР или метода ДНК-зондов.

Серодиагностика. Является ведущим методом диагностики вирусного гепатита G и контроля крови доноров. Антитела к антигенам вируса гепатита G в крови пациентов определяют с помощью чувствительных серологических реакций (ИФА, РИА и др.).

Глава 21

• Микробиологическая диагностика вирусного гепатита Е

МАТЕРИАЛ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ: кровь, испражнения, желчь.

МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ:

Вирусоскопическое исследование. Зрелые вирионы в испраж­нениях и желчи можно обнаружить с помощью метода элек­тронной микроскопии.

Экспресс-методы диагностики: иммунохимические и молеку-лярно-биологические исследования. Иммунохимические иссле­дования. Присутствие антигенов вируса в испражнениях мож­но определить с помощью метода ИЭМ (антигены цельных вирионов).

Молекулярно-биологические исследования. Ви­русную НК в исследуемом материале обнаруживают с помо­щью ПЦР или метода ДНК-зондов.

Серодиагностика. Является ведущим методом диагностики вирусного гепатита Е. Противовирусные антитела в крови па­циентов определяют с помощью чувствительных серологичес­ких реакций (ИФА, РИА и др.). Серодиагностику осуществля­ют методом парных сывороток (диагностическое значение име­ет нарастание титра антител в поздней сыворотке не менее чем в 4 раза) или на основании выявления (методом ИФА) специ­фических противовирусных иммуноглобулинов класса М (IgM), свидетельствующих об активной инфекции.

• Микробиологическая диагностика желтой лихорадки
МАТЕРИАЛ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ: кровь.

МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ:

Экспресс-методы диагностики. Молекулярно-биологи­ческие исследования. Вирусные нуклеиновые кислоты в исследуемом материале можно обнаружить с помощью ПЦР.

Серодиагностика. Является ведущим методом диагностики желтой лихорадки. Противовирусные антитела в крови паци­ентов определяют с помощью чувствительных серологических реакций (РСК, РТГА, ИФА, РИА и др.). Серодиагностику осуществляют методом парных сывороток (диагностическое значение имеет нарастание титра антител в поздней сыворотке не менее чем в 4 раза) или на основании выявления (методом ИФА) специфических противовирусных иммуноглобулинов класса М (IgM), свидетельствующих об активной инфекции.

• Диагностические, профилактические и лечебные
препараты

Стандартный Яй$-антиген. Применяют для серодиагностики вирусного гепатита В.

Иммуноглобулин нормальный человеческий. Получают из крови человека (донорской, плацентарной) путем фракциони­рования. Применяют для профилактики вирусного гепатита А при контакте (создание пассивного иммунитета).

Вакцина субъединичная против гепатита В. Получена генно-инженерным путем, содержит #&-антиген вируса гепатита В. Применяют для создания активного иммунитета с целью профилактики вирусного гепатита В. Вводят парентерально контингентам риска.

Иммуноглобулин человеческий amu-HBV. Получают путем фракционирования из крови доноров с высоким титром ан­тител к вирусу гепатита В. Применяют для профилактики вирусного гепатита В при контакте (создание пассивного иммунитета).

Вакцина живая ослабленная против желтой лихорадки. Со­держит авирулентный штамм вируса желтой лихорадки. При­меняют для профилактики желтой лихорадки (создание актив­ного иммунитета). Вводят контингентам риска.

Противовирусные препараты: интерферон человеческий лейко­цитарный; интерферон рекомбинантный. Применяют для лече­ния вирусного гепатита С.