Иммунологический метод исследования

Применяется главным образом с целью оценки иммунного статуса у больных (при системных или хронических заболеваниях) и для се­родиагностики либо иммуноиндикации инфекционной патологии.

Основным принципом оценки» результатов комплексного исследо­вания иммунного статуса является определение количественных и функциональных параметров всех его звеньев.

Оценка клеточного звена иммунной системы

Для выявления клеток иммунной системы используется определе­ние на их поверхности дифференцировочных антигенов - CD (Cell Differentiation antigens) с помощью моноклональных антител, мечен­ных флюорохромами (таблица 3 Приложения).

Для определения количества основных популяций и субпопуляций лимфоцитов используют метод визуального подсчега клеток с помо­щью люминисцентного микроскопа или автоматического проточного цитофпюориметра.

Оценка гуморального звена иммунной системы

Для обнаружения в сыворотке крови иммуноглобулинов или анти­тел к тому или иному микроорганизму или тканевому антигену при­меняют различные серологические методы, позволяющие визуализи­ровать образование комплекса антиген-антитело (Аг-Ат).

Преципитация - наиболее простой, но и наименее чувствительный метод выявления Аг или Ат. Преципитация в растворе служит для оп­ределения титра Ат, при этом растворимый Аг в постоянной дбзе до­бавляют к исследуемой сыворотке, взятой в последовательных дву­кратных разведениях 1:2, 1:4, 1:8 и т.д. Картину преципитации оцени­вают визуально или с помощью нефелометрии по степени помутнения раствора. Преципитация в геле один из двух реагентов включают в агар (обычно это специфические антисыворотки), другой реагент (Аг) в двукратных разведениях вносят в лунки, откуда он диффундирует в агар. При оптимальном соотношении Аг и Ат образуется преципитат в виде белой линии.

Агглютинация - Аг представлен в корпускулярной форме (прямая агглютинация эритроцитов или бактерий) либо связан с частицами носителя (эритроциты, латекс) - непрямая или пассивная агглютина­ция. Чувствительность реакции значительно превосходит реакцию преципитации.

Реакция связывания комплемента — основана на том, что компле­мент принимает участие в многочисленных реакциях связывания Аг с Ат. Постановку опыта осуществляют в два этапа. На первом этапе ис­следуемую сыворотку и известный Аг инкубируют с комплементом. Па втором этапе к смеси реагентов добавляют индикаторную систему, состоящую из гемолитической сыворотки и эритроцитов. При взаимо­действии Аг с Ат на первом этапе комплемент связывается и не может участвовать в гемолитической реакции на втором этапе, поэтому ге­молиз отсутствует или выражен незначительно. Если комплекс Аг-Ат не образуется, комплемент полностью включается в индикаторную систему, что сопровождается полным гемолизом. Эта реакция облада­ет достаточно высокой чувствительностью и применяется для диаг­ностики сифилиса, вирусных инфекций и некоторых аутоиммунных заболеваний.

Чувствительность методов, основанных на связывании Аг и Ат, существенно повышается при связывании последних с различными метками - радиоизотопной или ферментной. В диагностике инфекци­онных заболеваний широкое применение нашел иммуноферментный анализ (ИФА). Для выявления Ат к бактериальным Аг чаще всего ис­пользуют непрямой ИФА. Для этого фиксированный на носителе бак­териальный Аг инкубируют с исследуемой сывороткой крови пациен­та. При наличии в сыворотке крови соответствующих Ат они связы­ваются с Аг, а образующийся комплекс Аг-Ат выявляется с помощью меченных ферментом Ат против иммуноглобулинов человека (конъюгат). Ферментативная активность метки регистрируется по степени разложения субстрата, изменение окраски которого находится в пря­мой зависимости от количества Ат, содержащихся в исследуемой сы­воротке. Чем больше Ат содержится в сыворотке, тем более интен­сивно окрашивается субстратная смесь. Для выявления Аг использу­ются как сэндвич-метод, так и варианты конкурентных реакций. Сэн­двич-метод (двойных Ат) подразумевает применение специфических Ат против одного или нескольких бактериальных поливалентных Аг. При этом используют моноклональные Ат или комплекс сывороточ­ных иммуноглобулинов, которые фиксируют на твердом носителе (твердая фаза) и метят ферментом (конъюгат). Исследуемый образец сыворотки инкубируют с твердой фазой для образования комплекса Аг-Ат. Образовавшийся комплекс Ат с поливалентным Аг после ста­дии многократного отмывания инкубируют с конъюгатом, а затем с соответствующим метке субстратом. Интенсивность окраски суб­стратной смеси находится в прямой зависимости от содержания Аг в исследуемом образце сыворотки. Возможен как визуальный, так и ин­струментальный учет результатов с помощью спектрофотометра. В настоящее время стандартные наборы для диагностики инфекционных заболеваний на основе ИФА сопровождаются подробной инструкцией по выполнению всех этапов выявления Ат или Аг, что исключает не­обходимость подробного описания техники исследования.

Вирусологический метод исследования

В клиническом материале обнаруживают вирус, заражая экспери­ментальных животных, куриные эмбрионы или культуры клеток. По характеру цитопатического действия и с помощью серологических ре­акций идентифицируют вирус по Аг. Метод используется в специали­зированных вирусологических лабораториях, служит главным обра­зом для ретроспективной диагностики вирусных инфекций.