Полимеразная цепная реакция

Основные понятия и ключевые слова к теме:

Нуклеиновая кислота Нуклеотид

Азотистые основания Репликация

Генетическая информация Ген

Транскрипция Генетический код

Кодон, генетический антикодон Трансляция

Аминокислота Биосинтез белка

Полимераза

ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота – биологическая макромолекула, носитель генетической информации во всех эукариотических и прокариотических клетках и во многих вирусах.

В 1928 г. Ф. Гриффит обнаружил у пневмококков явление трансформации (преобразование свойств бактерий). Природа трансформирующего агента была установлена Эвери, Мак-Леодом и Мак-карти в 1944 г., им оказалась ДНК. Так открытие и изучение трансформации доказало роль ДНК как материального носителя наследственной информации.

Трехмерная модель пространственного строения двухцепочечной ДНК была описана в аперльском журнале Nature в 1953 г. Дж. Уотсоном, Френсисом Криком и Морисом Уилкинсом. Эти исследования легли в основу молекулярной биологии, изучающей основные свойства и проявления жизни на молекулярном уровне.

Структура ДНК – полимер, структурной единицей которого является нуклеотид.

Нуклеотид состоит из азотистого основания пуринового: аденин (А) или гуанин (Г) или пиримидинового: цитонин (Ц) или тимин (Т), углевода дезоксирибозы (пятиуглеродное сахарное кольцо) и остатка фосфорной кислоты (НРО^-₃). Двойная спираль ДНК правосторонняя. 10 пар оснований составляют полный оборот 360^о, следовательно, каждая пара оснований повернута на 36 градусов вокруг спирали относитльно следующей пары. Фосфатные группировки находятся снаружи спиралей, а основания – внутри и расположены с интервалом 34нм. Цепи удерживаются вместе водородными связями между основаниями и закручены одна вокруг другой и вокруг общей оси.

В разработке модели ДНК важную роль сыграли наблюдения Чаргаффа (1949) о том, что количественные отношения гаунина всегда равны содержанию цитозина, а содержание аденина соответствует содержанию тимина. Это положение было названо «правило Чаргаффа»:

А=Т; Г=Ц или А+Г/Ц+Т=1

Нуклеотиды соединены в полинуклеотидную цепь связями между 5’ положения одного пентозного конца и 3’ положения следующего пентозного кольца через фосфатную группу с образованием фосфодиэфирных мостиков, т.е. сахарно-фосфатный остов ДНК состоит из 5’ – 3’ связей. Генетическая информация записана в последовательности нуклеотидов в направлении от 5’ конца к 3’ концу – такая нить называется смысловой ДНК, здесь расположены гены. Вторая нить направления 3’-5’ считается антисмысловой, но является необходимым «эталоном» хранения генетической информации. Антисмысловая нить играет большую роль в процессах репликации и репарации (восстановление структуры поврежденной ДНК). Основания в антипараллельных нитях образуют за счет водородных связей комплементарны пары: А+Т; Г+Ц. Таким образом, структура одной нити определяет последовательность нуклеотидов другой нити. Следовательно, последовательности оснований в нитях ДНК всегда антипараллельны и комплементарны.

Принцип комплементарности универсален для процессов репликации и транскрипции.

В настоящее время описаны несколько модификаций молекулы ДНК. Полиморфизм ДНК – это способность молекулы принимать различные конфигурации.

Знание структуры и функции ДНК необходимо для понимания сути некоторых генетических процессов, которые являются матричными. Было ясно, что сама ДНК не может играть роль матрицы при синтезе белков из аминокислот, т.к. почти вся она находится в хромосомах, расположенных в ядре, в то время как большинство, если не все, клеточные белки синтезируются в цитоплазме. Таким образом, генетическая информация, заключенная в ДНК, должна предаваться какой-то промежуточной молекуле, которая транспортировалась бы в цитоплазму и участвовала в синтезе полипептидных цепей. Предположение о том, что такой промежуточной молекулой может быть РНК, стало всерьез рассматриваться сразу, как только была открыта структура двойной спирали ДНК. Во-первых, клетки, синтезирующие большое количество белка, содержали много РНК. Во-вторых, еще более важным казалось то, что сахарофосфатные «скелеты» ДНК и РНК чрезвычайно сходны и было бы легко представить себе, как происходит синтез одиночных цепей РНК на одноцепочной ДНк с образованием нестабильных гибридных молекул, одна цепь которых представлена ДНК, а другая РНК. Взаимоотношения ДНК, РНК и белка в 1953 г. были представлены в виде следующей схемы:

транскрипция трансляция

Репликация ДНК---------→ РНК---------→ белок,

где одиночные цепи ДНК служат матрицами при синтезе комплементарных молекул ДНК (репликация). В свою очередь, молекулы РНК служат матрицами для последовательного соединения аминокислот с образованием полипептидных цепей белков в процессе, названном так потому, что «текст», написанный на «языке» нуклеотидов, переводится (транслируется) на «язык» аминокислот. Группа нуклеотидов, кодирующая одну аминокислоту, называется кодоном.

РНК – рибонуклеиновая кислота, имеет много общего со структурой ДНК, но отличается от нее рядом признаков:

q углеводом РНК, к которому присоединяются пуриновые или пиримидиновые основания и фосфатные группы, является рибоза;

q в состав РНК, как и в состав ДНК, входят азотистые основания аденин, гуанин и цитозин. Но РНК не содержит тимина, его место в молекуле РНК занимает урацил;

q РНК – одноцепочечная молекула;

q так как молекула РНК одноцепочечная, то правило Чаргаффа, установленное для ДНК, может не выполняться по равенству содержания оснований.

Рибонуклеиновые кислоты (РНК), присутствующие в клетках как про- так и эукариот, бывают трех основных видов: матричные РНК (мРНК), рибосомные РНК (рРНК) и транспортные РНК (тРНК).

В ядре клеток эукариот содержится РНК четвертого типа гетерогенная ядерная РНк (гяРНК), которая является точной копией (транскриптом) соответствующей ДНК.

Молекулы тРНК узнают в цитоплазме соответствующий триплет (кодон в мРНК) и переносят нужную аминокислоту к растущей полипептидной цепи. Узнавание кодона в мРНК осуществляется с помощью трех последовательных оснований в тРНК, называемых антикодонами. Считают, что для каждой аминокислоты имеется, по крайней мере, одна тРНК.

Генетический код - единая система записи наследственной информации в молекулах нуклеиновых кислот в виде последовательности нуклеотидов. Генетический код основан на использовании алфавита, состоящего всего из четырех букв –нуклеотидов, отличающихся азотистыми основаниями: А, Т, Ц, Г. Попытки расшифровки генетического кода были предприняты в 1954 г. Г.Гамовым. основные свойства кода триплетность и вырожденность выявили в 1961 г. Ф. Крик и С. Бреннер.

В 1961 г. была впервые дешифрована первая триплетная последовательность. Система, содержащая искусственную мРНК, состоящую только из урациловых нуклеотидов, синтезировала полипептидную цепь, состоящую только из фенилаланина (в ДНК кодом для нее должен быть комплементарный триплет нуклеотидов – ААА). К 1965 г. был расшифрован полностью весь генетический код. Из 64 кодонов три кодона УАГ, УАА, УГА не кодируют аминокислот, они были названы нонсенс-кодонами. Позднее было показано, что они являются терминирующими кодонами.

В настоящее время определение нуклеотидных последовательностей ДНК и РНК проводится с помощью специального метода – секвенирования.

Свойства генетического кода.

1. Генетический код триплетен. Триплет (кодон) – последовательность трех нуклеотидов, кодирующая одну аминокислоту.

2. Вырожденность генетического кода обусловлена тем, что одна аминокислота может кодироваться несколькими триплетами (аминокислот – 20, а триплетов – 64), исключение составляют метионин и триптофан, которые кодируются только одним триплетом. Три триплета УАА, УАГ, УГА – это стоп-сигналы (терминирующие кодоны), прекращающие синтез полипептидной цепи. Триплет, соответствующий метионину (АУГ), выполняет функцию инициирования (возбуждения) считывания и не кодирует аминокислоту, если стоит в начале цепи ДНК.

3. Однозначность – каждому данному кодону соответствует одна и только одна определенная аминокислота.

4. Генетический код не перекрываем – процесс считывания генетического кода не допускает возможности перекрывания кодонов. Начавшись на определенном кодоне, считывание следующих идет без пропусков вплоть до нонсенс-кодонов.

5. Генетический код универсален, т.е. вся информация в ядерных генах для всех организмов, обладающих разным уровнем организации кодируется одинаково.

Матричные процессы в клетке.

Существуют три типа матричных процессов в клетках: репликация, транскрипция и трансляция.

Основное функциональное значение процесса репликации ДНК заключается в снабжении потомства генетической информацией, которая должна передаваться полностью и с очень высокой точностью.

Репликация – удвоение ДНК, происходящее в синтетическую (S) стадию интерфазы пред каждым делением клетки.

Консервативная репликация. Исходная двухцепочная молекула ДНК служит матрицей для образования совершенно новой двухцепочечной молекулы, нацело достраивающейся на исходной.

Полуконсервативная репликация. Две нити ДНК расплетаются (как застежка - молния). Каждая цепь служит матрицей для образования новой. При репликации молекула ДНК постепенно разделяется специальным ферментом на две половины в продольном направлении. По мере того, как открываются нуклеотиды разделяемой молекулы, к ним тут же присоединяются свободные нуклеотиды, раннее синтезированные в цитоплазме. В результате каждая половинная спираль снова становиться целой, и вместо одной молекулы получаются две, в результате чего хромосома становится двухроматидной.

Дисперсионная репликация. Исходная ДНК распадается на короткие разной длины фрагменты, используемы в качестве матриц для постоения фрагментов двух новых двойных спиралей, которые затем воссоздаются в единую структуру молекулы. Образованные молекулы ДНК содержат старые и новые фрагменты.

М.Мезельсон и Ф. Сталь, используя авторадиографический метод, показали, что полуконсервативный метод репликации характерен для всех эукариот и большинства прокариот.

В 1955 г. А. Корнберг и его коллеги из Стенфордского университета открыли фермент, который обеспечивает репликацию ДНК, и назвали его полимеразой.

На современном этапе среди ферментов, участвующих в синтезе ДНК, выделены ДНК-полимеразы I, II, III, обладающие 5’→ 3’ полимеразной активностью.

Поскольку ДНК- полимеразы катализируют репликацию только в направлении 5’→ 3’, а цепи родительской ДНК антипараллельны, только одна из новых цепей синтезируется непрерывно. Эта цепь называется лидирующей. Вторая цепь, называемая отстающей, синтезируется в виде фрагментов ДНК – фрагменты Оказаки, которые у эукариот имеют последовательность 100-200 нуклеотидов. Эти фрагменты лигируются (сшиваются) полинуклеотидлигазами, и образуется непрерывная цепь. Этот процесс называется созреванием. Синтез каждого фрагмента Оказаки (3’→ 5’) начинается на маленьком фрагменте РНК (около 10-60 нуклеотидов), который удаляется еще до окончания считывания фрагмента. Это так называемая затравка, или праймер.

В любой клетке человека под влиянием различных факторов в ДНК ежедневно происходят тысячи случайных изменений, а за год в каждой клетке накапливается лишь очень небольшое число стабильных изменений нуклеотидной последовательности ДНК. Среди множественных случайных замен оснований в ДНК лишь одна на тысячу приводит к возникновению мутации. Все остальные повреждения очень эффективно ликвидируются в процессе репарации ДНК. Механизм репарации («залечивание» повреждений ДНК) основан на том, что молекула ДНК имеет две копии генетической информации – по одной в каждой из нитей молекулы. Основной путь репарации включает три этапа:

1. Измененный участок поврежденной цепи ДНК распознается и удаляется с помощью ДНК-репарирующих нуклеаз. В спирали ДНК в этом месте возникает брешь;

2. ДНК –полимераза и гликозилазы заполняют эту брешь, присоединяя нуклеотиды один за другим, копируя информацию с целостной нити;

3. ДНК – лигаза «сшивает» разрывы и завершает восстановление молекулы.

Транскрипция (переписывание) – синтез на ДНк-матрице мРНК (первичного продукта гена), осуществляющийся в ядре на смысловой нити ДНК, находящейся в релаксированном состоянии. Это первый этап белкового синтеза. Матричная РНК (мРНК) содержит генетическую инструкцию по синтез определенного полипептида и переносит ее к белоксинтезирующему аппарату клетки, находящемуся в рибосомах цитоплазмы клеток.

Для инициации транскрипции необходимо наличие специального участка в ДНК, называемого промотором. Когда РНК-полимераза связывается с промотором, происходит локальное расплетание двойной спирали ДНК и образуется открытый промоторный участок.

Элонгация (удлинение) цепи РНК – это стадия транскрипции, которая наступает после присоединения 8 рибонуклеотидов. При этом движущаяся РНК-полимераза вдоль цепи ДНК действует подобно застежке молнии, раскрывая двойную спираль, которая замыкается позади фермента по мере того, как соответствующие основания РНК спариваются с основаниями ДНК.

Терминация (прекращение роста) цепи мРНК происходит на специфических участках ДНК, называемых терминаторами.

Процесс формирования зрелых молекул РНК из предшественников называется процессингом, в результате которого молекулы подвергаются модификации по 5’→ 3’ концам и сплайсингу. Сплайсинг гетерогенной ядерной РНК это удаление последовательностей РНК, соответствующих интронам ДНК, и соединение участков с транскрибируемыми последовательностями экзонов.

Трансляция (перевод) – процесс воплощения генетической информации мРНК в структуру полипептида. Это второй этап белкового синтеза, осуществляемый последовательной поликонденсацией отдельных аминокислотных остатков, начиная с аминоконца полипептидной цепи к карбоксильному концу.

Зрелая матричная РНК выходит в цитоплазму, где осуществляется процесс трансляции – декодирование мРНК в аминокислотную последовательность белка. Процесс декодирования осуществляется от 5’→ 3’ и происходит в рибосомах. Комплекс мРНК и рибосом называется полисомой.

Трансляция начинается со старого кодона АУГ, который при локализации в смысловой части структурного гена кодирует аминокислоту метионин. Каждую аминокислоту доставляет к полисоме транспортная РНК (тРНК), специфичная к данной аминокислоте. тРНК выполняет роль посредника между кодоном мРНК и аминокислотой. Молекулы тРНК узнают в цитоплазме соответствующий триплет (кодон в мРНК) по принципу спаривания комплементарных азотистых оснований. тРНК, которая подходит к малой субчастице, образует связь кодон – антикодон, при этом одновременно передает свою аминокислоту в аминоацильный участок (А-участок) большой субъединице. К кодону АУГ «подходит» антикодон только той тРНК, которая преносит метионин. Поэтому прежде всего к рибосоме доставляется метионин. Затем кодон АУГ переходит на пептидильный участок большой субъединицы (Р-участок). В результате этих процессов образуется транслирующая рибосома – инициирующий комплекс.

Терминация (окончание синтеза) происходит по команде кодонов УАА, УАГ, УГА. В природе не существует таких молекул тРНК, антикодоны которых соответствовали бы этим кодонам.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) была открыта в 1984 г. Кэри

Б. Мюллисом. Она основана на том, что новосинтезируемые цепи нуклеиновых кислот могут служить матрицами в следующих циклах репликации:

q двухспиральная ДНК при нагревании разделяется на состовляющие одноцепочные цепи и в таком состоянии может служить матрицей для репликации;

q одноцепочные нити ДНК инкубируются в присутствии ДНК-полимеразы и раствора, содержащего смесь всех 4 нуклеотидов, а также специфические последовательности ДНК (праймеры), что приводит к синтезу копий двух молекул ДНК.

Затем процедуры повторяются сначала, и происходит копирование как старых, так и новых одноцепочечных цепей с образованием третьей и четвертой молекулы ДНК, затем все четыре снова копируются и тд. В результате 20-30 циклов амплифицируется (увеличивается число копий) эффективное количество ДНК. Отдельный цикл занимает около 5 мин, а для бесклеточного молекулярного клонирования фрагмента ДНК требуется всего несколько часов.

Метод ПЦР отличается очень высокой чувствительностью: он позволяет обнаружить в пробе всего одну присутствующую в ней молекулу ДНК. Метод получил широкое использование в пренатальной диагностике наследственных болезней, выявлении вирусных инфекций, а также в судебной медицине, поскольку дает возможность проводить генетическую «дактилоскопию» даже по одной единственной клетке.