2015-06-28
1118
Цель исследований: исследования влияния концентрационных эффектов суперпарамагнитных наночастиц оксида железа на скорости релаксации R2*, R2, R1 протонов дистиллированной воды, геля “агар-агар”, раствора альбумина.
Объекты исследований: суперпарамагнитные наночастицы оксида железа в модельных водных растворах: в дистиллированной воде, в 2% геле «агар-агар» (смесь молекул воды и биомакромолекул полисахаридов агарозы и агаропекина), в водном растворе альбумина (50 г/л) (смеси воды и простых, растворимых в воде белков). В дальнейшем последние две смеси мы для упрощения иногда будем называть системой «биополимер-вода».
Приборные средства измерений:
1) Фурье спектрометр ядерного магнитного резонанса СХР-300 (Брукер, Германия) с величиной магнитного поля 7.1 Тл. Все измерения осуществлялись в стандартных стеклянных ампулах диаметром 5 мм без вращения. Резонансная частота на ядрах протонов - 300 МГц.
2) ЯМР релаксометр «Спин Трэк» с величиной магнитного поля 0.33 Тл. Резонансная частота на ядрах протонов - 14 МГц.
|
|
|
Подготовка к измерению: в стандартные стеклянные ампулы диаметром 5 мм для записи ЯМР спектров вносили по 500 мкл суспензий и добавляли по 50 мкл тяжелой воды («Изотоп») с тем, чтобы получить сигнал ЯМР дейтерия, необходимый для стабилизации магнитного поля. Концентрация железа в образце определялась переводом водной суспензии в раствор трехвалентного железа и последующего спектрофотометрического тестирования тиоцианатного комплекса железа на УФ-спектрофотометре.
Исследуемые параметры: скорости релаксации R2*, R2, R1.
Параметры импульсных последовательностей
Для измерения времени Т1 и, соответственно, скорости релаксации R1=1/T1 использовалась импульсная последовательность «инверсия-восстановление» 180°-t-90° (длительность 90° импульса 4.6 мкс; длительность 180° импульса 8.9 мкс; длительности пауз между 180° и 90° импульсами находились в пределах от 10 мкс до 10 с, всего 16 точек; длительность паузы между 180° импульсами 10 с).
Для измерения времени спин-спиновой релаксации Т2 и, соответственно, скорости релаксации R2=1/T2 применяли последовательность импульсов Carr-Purcell-Meilboom-Gill (длительность 90° импульса 4.6 мкс; длительность 180° импульса 8.9 мкс; время эхо от 1 мкс до 7 мс для разных образцов; 512 сигналов эхо).
Скорость R2* вычислялась по ширине линии спектра (R2*=πΔυ1/2), где Δυ1/2 – ширина спектральной линии на половине высоты. Измерения проводились только на частоте 300 МГц, использовалась одноимпульсная последователь (длительность 90° импульса 0.5 мкс, пауза между импульсами 3 с, количество накоплений от 4 до 32 в зависимости от уровня шумов).
|
|
|
Полученные экспериментальные значения скоростей релаксации R2*, R2, R1 протонов в различных средах при разных концентрациях суперпарамагнитных наночастиц оксида железа представлены в таблице 4 (для частоты ЯМР 300 Мгц) и таблице 5 (для частоты ЯМР 14 МГц).
Таблица 4. Скорости релаксаций, измеренные на частоте ЯМР 300 МГц в различных средах с разным содержанием наночастиц оксида железа.
| 2% гель “агар-агар” с наночастицами оксида железа | Вода дистиллированная с наночастицами оксида железа | Водный раствор альбумина 50 г/л с наночастицами оксида железа | |||||||
| C(Fe3+), мМ/л | R2*, 1/c | R2, 1/c | R1, 1/c | R2*, 1/c | R2, 1/c | R1, 1/c | R2*, 1/c | R2, 1/c | R1, 1/c |
| 0.5 | 345±10 | 208±6 | 0.95±0.02 | 345±10 | 49±1 | 0.72±0.02 | 345±10 | 92±3 | 0.87±0.03 |
| 729±22 | 474±14 | 1.56±0.05 | 537±16 | 78±2 | 1.02±0.03 | 653±20 | 172±5 | 1,10±0.03 | |
| 1341±40 | 870±26 | 2.5±0.1 | 691±21 | 126±4 | 1.69±0.05 | 1000±30 | 287±9 | 1,64±0.05 | |
| 2148±64 | 1466±44 | 4.0±0.1 | 729±22 | 220±7 | 2.61±0.08 | 1303±40 | 459±14 | 2,47±0.07 | |
| 3988±120 | 2564±77 | 6.9±0.2 | 1162±35 | 435±13 | 4.9±0.2 | 1815±54 | 788±24 | 4,2±0.1 | |
| 5872±176 | 3636±109 | 9.7±0.3 | 1570±47 | 690±21 | 7,7±0.2 | 2490±75 | 1299±39 | 7,1±0.2 | |
| 8356±250 | 5236±157 | 13.8±0.4 | 1840±55 | 841±25 | 10,8±0.3 | 3140±94 | 1613±48 | 8,9±0.3 |
Таблица 5. Скорости релаксаций, измеренные на частоте ЯМР 14 МГц в различных средах с разным содержанием наночастиц оксида железа.
По результатам измерений были построены графики зависимости скоростей продольной R1 и поперечной R2 ядерной магнитной релаксациипротонов воды от концентрации суперпарамагнитных наночастиц оксида железа в дистиллированной воде (рис. 36 и 37), в геле “агар-агар” (рис. 38 и 39), в растворе альбумина (рис.40 и 41) для двух частот ЯМР: 300 и 14 МГЦ.
Рисунок 36. Концентрационная зависимость скорости релаксации R1, полученная на частотах ЯМР 300 Мгц (поле B0 = 7.1 Тл) и 14МГц (поле B0 = 0.33 Тл) для образцов дистиллированной воды с различным содержанием наночастиц оксида железа.
Рисунок 37. Концентрационная зависимость скорости релаксации R2, полученная на частотах ЯМР 300 Мгц (поле B0 = 7.1 Тл) и 14МГц (поле B0 = 0.33 Тл) для образцов дистиллированной воды с различным содержанием наночастиц оксида железа.
Рисунок 38. Концентрационная зависимость скорости релаксации R1, полученная на частотах ЯМР 300 Мгц (поле B0 = 7.1 Тл) и 14МГц (поле B0 = 0.33 Тл) для образцов геля “агар-агар” с различным содержанием наночастиц оксида железа.
Рисунок 39. Концентрационная зависимость скорости релаксации R2, полученная на частотах ЯМР 300 Мгц (поле B0 = 7.1 Тл) и 14МГц (поле B0 = 0.33 Тл) для образцов геля “агар-агар” с различным содержанием наночастиц оксида железа.
Рисунок 40. Концентрационная зависимость скорости релаксации R1, полученная на частотах ЯМР 300 Мгц (поле B0 = 7.1 Тл) и 14МГц (поле B0 = 0.33 Тл) для образцов водного раствора альбумина с различным содержанием наночастиц оксида железа.
Рисунок 41. Концентрационная зависимость скорости релаксации R2, полученная на частотах ЯМР 300 Мгц (поле B0 = 7.1 Тл) и 14МГц (поле B0 = 0.33 Тл) для образцов водного раствора альбумина с различным содержанием наночастиц оксида железа.
Обработка результатов измерений:
1. Времена релаксации Т1, Т2 определяли по спаду сигнала ядерной индукции протонов воды с помощью программ Excel по методу наименьших квадратов.
2. На основании данных для образцов с различной концентрацией суперпарамагнитных наночастиц оксида железа строили зависимость скорости релаксации R1 = 1/Т1 и R2 = 1/Т2 от концентрации суперпарамагнитных наночастиц в исследуемых растворах.
3. Зависимость скорости релаксации R1 и R2 от концентрации наночастиц аппроксимировали линейной зависимостью по методу наименьших квадратов с использованием программы Excel.
В качестве критерия контрастирующей эффективности суперпарамагнитных наночастиц оксида железа использовали коэффициент релаксационной эффективности, который рассчитывали как коэффициент пропорциональности ri эмпирической зависимости скоростей магнитной продольной R1 и поперечной R2 релаксации протонов молекул воды от концентрации магнитных наночастиц в исследуемых растворах
|
|
|
Ri = ri∙C + A,
где С - концентрация магнитных наночастиц, выраженная в мМ, А - константа, определяемая скоростью релаксации протонов воды в отсутствие суперпарамагнитных наночастиц.
Анализ концентрационных зависимостей скоростей продольной и поперечной релаксации протонов дистиллированной воды и систем «биополимер – вода» в присутствии суперпарамагнитных наночастиц оксида железа показывает, что:
- скорость продольной релаксации протонов дистиллированной воды и систем «биополимер – вода» возрастает линейно с увеличением концентрации суперпарамагнитных молекул;
- с уменьшением индукции магнитного поля (в пределах исследованного диапазона) скорость продольной релаксации протонов дистиллированной воды и систем «биополимер – вода» растет, что свидетельствует о наличии частотной дисперсии времен спин-решеточной ЯМР релаксации. И чем выше концентрация суперпарамагнитных наночастиц оксида железа в водном растворе, тем больше рост скорости продольной релаксации в более низком магнитном поле;
- скорость поперечной релаксации протонов дистиллированной воды и систем «биополимер – вода» возрастает линейно с увеличением концентрации суперпарамагнитных молекул;
-с уменьшением индукции магнитного поля (в пределах исследованного диапазона) рост скорости поперечной релаксации для протонов дистиллированной воды практически одинаков, а для протонов систем «биополимер – вода» ее рост незначителен.
По результатам измерений были также построены графики зависимостей скорости эффективной спин-спиновой (поперечной) R2* ядерной магнитной релаксациипротонов воды от концентрации суперпарамагнитных наночастиц оксида железа в дистиллированной воде (рис. 42), в геле “агар-агар” (рис. 43) и в растворе альбумина (рис.44) для частоты ЯМР 300 МГЦ.
Анализ этих зависимостей показывает, что скорость эффективной поперечной релаксации протонов дистиллированной воды и систем «биополимер – вода» возрастает линейно с увеличением концентрации суперпарамагнитных молекул. Наиболее значительный рост скорости эффективной поперечной релаксации протонов наблюдается для геля “агар-агар”.
|
|
|
Рисунок 42. Концентрационная зависимость скорости релаксации R2*, полученная на частоте ЯМР 300 Мгц (поле B0 = 7.1 Тл) для образцов дистиллированной воды с различным содержанием наночастиц оксида железа.
Рисунок 43. Концентрационная зависимость скорости релаксации R2*, полученная на частоте ЯМР 300 Мгц (поле B0 = 7.1 Тл) для образцов геля “агар-агар” с различным содержанием наночастиц оксида железа.
Рисунок 44. Концентрационная зависимость скорости релаксации R2*, полученная на частоте ЯМР 300 Мгц (поле B0 = 7.1 Тл) для образцов водного раствора альбумина с различным содержанием наночастиц оксида железа.
В результате проведенных исследований были определены релаксационные эффективности (релаксивности) ri = (1/C · Тi) (мМ · с/л)-1 суперпарамагнитных наночастиц оксида железа в дистиллированной воде, геле «агар-агар» и водном растворе альбумина (Таблица 6).
Таблица 6. Релаксационные эффективности наночастиц оксида железа в разных средах, измеренные на частотах 300 МГц и 14 МГц.
| Релаксационные эффективности наночастиц оксида железа | В 2% геле агар-агар | В дистиллированной воде | В водном растворе альбумина 50 г/л с | Частота, МГц |
| r2*, л/мМ*с | 817±25 | 153±5 | 277±8 | |
| r2, л/мМ*с | 508±15 | 87±3 | 162±5 | |
| r1, л/мМ*с | 1.30±0.04 | 1.05±0.03 | 0.86±0.03 | |
| r2, л/мМ*с | 395±12 | 54±2 | 159±5 | |
| r1, л/мМ*с | 45±1 | 9.6±0.3 | 21.4±0.6 |
Анализ данных таблицы 6 показывает, что:
- релаксационные эффективности r1 для суперпарамагнитных наночастиц оксида железа в дистиллированной воде и системах «биополимер – вода» повышаются в более низком магнитном поле, достигая наибольших абсолютных значений r1 в геле «агар-агар». Увеличение релаксивностей r1 для более низкого магнитного поля В0 в системах «биополимер – вода» позволяет сделать вывод о том, что суперпарамагнитные наночастицы оксида железа могут быть использованы в низких магнитных полях как контрастирующие T1 агенты;
- релаксационная эффективность r2 для суперпарамагнитных наночастиц оксида железа в дистиллированной воде и системах «биополимер – вода» наоборот уменьшается в более низком магнитном поле, хотя и незначительно;
- наибольшее абсолютное значение релаксационной эффективности зафиксировано для r2* в геле «агар-агар» в более высоких магнитных полях, что свидетельствует о наличии у суперпарамагнитных наночастиц оксида железа свойств Т2* контрастирующих агентов, которые усиливаются при повышении индукции магнитного поля В0.
- сокращение T2* протонов воды суперпарамагнитными наночастицами оксида железа объясняется релаксацией, индуцированной диффузией молекул воды в пределах градиентного магнитного поля вокруг парамагнитного гидратированного иона.
Исследования ЯМР контрастирующих свойств нанодисперсных частиц оксида железа в зависимости от размера, формы, заряда, химического состава и гидрофильных (гидрофобных) свойств оболочки
Контрастирующие свойства нанодисперсных частиц оксида железа находятся в прямой зависимости от релаксационной эффективности частиц, то есть их способности влиять на времена ядерной магнитной релаксации протонов растворителя в непосредственном окружении этих частиц. Установлено, что величина интенсивности томографических изображений в методе МРТ определяется не только протонной плотностью выбранного участка наблюдения (воксель), но и скоростью магнитной релаксации ядер в постоянном магнитном поле, причем в большинстве случаев существует также прямая взаимосвязь между скоростью релаксации протонов растворителя и концентрацией магнитных центров. Поэтому в качестве критерия контрастирующей эффективности нанодисперсий оксида железа можно использовать релаксационную эффективность частиц в суспензии, измеренную по временам магнитной релаксации ЯМР. В основу подхода были положены измерения зависимости времен ядерной магнитной релаксации протонов воды от концентрации магнитных наночастиц в суспензии.
Исследована релаксационная эффективность магнитных наночастиц оксида железа, стабилизированных глицином, декстраном и хитозаном. Суспензии оксида железа получали методом соосаждения по схеме Массарата с последующей стабилизацией заряженным ионом глицина, нейтрального низкомолекулярного декстрана и хитозана. В зависимости от глубины реакции получали суспензии частиц разной устойчивости. Предварительными наблюдениями установлено, что степень агрегации и, следовательно, размер частиц в суспензии влияет на время седиментации супензии. Осаждение ускоряется при внесении образцов в поле магнита. Наночастичные образцы с размером ниже 100 нм сохраняли устойчивость в течении суток, а образцы с размером частиц выше 300 нм были неустойчивы и быстро расслаивались. Измерения спектров ЯМР и времен магнитной релаксации проводили в сравнении с растворами хлорного железа. Все спектры протонного резонанса имели вид одиночной линии ЯМР воды. Изменения вида спектров при варьировании дисперсий касались только формы линии, которая полностью характеризовалась единственным параметром ширины на половине высоты. Результаты измерений ширины линии представлены в графической форме и суммарной таблице значений релаксационной эффективности r (Таблица 7).
На рис. 45 приведена зависимость ширины линии протонов воды в суспензии от концентрации наночастиц, покрытых декстраном и глицином с размером частиц менее 100 нм. Наночастицы магнетита, покрытые глицином и декстраном, близким образом уширяют линии резонанса протонов воды.
Рисунок 45. Зависимость ширины линии ЯМР 1Н воды от концентрации наночастиц магнетита, покрытых декстраном и глицином.
На рис 46 приведена зависимость скорости релаксации 1/Т 2 протонов воды от концентрации наночастиц магнетита в различной оболочке, измеренных методом спинового эха. Концентрационные зависимости соответствуют линейной зависимости общего вида Ri = ri∙C + A (обозначения см. выше), что позволяет вычислить коэффициент релаксационной эффективности ri по соотношению: ri = (1/C · Тi) (мМ · с/л)-1.
Рисунок 46. Зависимость скорости релаксации ЯМР Н1 от концентрации ионов железа в суспензии наночастиц и раствора хлорного железа.
Результаты измерений релаксационной эффективности синтезированных препаратов магнитных наночастиц обобщены в таблице 7.
Таблица 7. Результаты измерений релаксационной эффективности магнитных наночастиц оксида железа.
| N | Стабилизатор | Релаксационная эффективность, r2, л×ммоль-1×с-1 | Примечание |
| глицин | 130 ±5 | Дисперсия неустойчивая | |
| декстран | 130 ±7 | Супернатант, низкая концентрация Fe | |
| декстран | 6,7 | Устойчивая дисперсия, высокая концентрация Fe | |
| декстран | 4,6 | Устойчивая дисперсия, высокая концентрация Fe | |
| хитозан | 5,0 | Устойчивая дисперсия, высокая концентрация Fe |
Релаксационная эффективность наночастиц магнетита, стабилизированного декстраном и глицином составила 130× с-1 ммоль-1 л в диапазоне концентрации ионов железа 0.05-0.20 ммоль/л, что на порядок превышало релаксационную эффективность парамагнитных ионов Fe. Было проверено влияние суперпарамагнитных частиц оксида железа на спин-решеточную релаксацию протонов воды. Оказалось, что при добавлении первой порции суспензии наночастиц время спин-решеточной релаксации Т1 уменьшилось в 1.25 раза, в то время как при той же концентрации наночастиц, время спин-спиновой релаксации уменьшилось в 14 раз. Наночастицы оксида железа в наибольшей степени влияют на время спин-спиновой релаксации протонов воды Т2. На этом основании можно отнести препараты оксида железа, стабилизированные декстраном и глицином, к контрастирующим веществам негативного действия.
Релаксационная эффективность препаратов железа сильно зависит от химического состава ядра. При полном окислении магнетита в окись железа путем продувания кислорода суспензии частиц эффект сокращения времен релаксации пропадает, линия ЯМР воды сужается до значений нескольких десятков герц. При неполном окислении (краткая продувка воздухом) также намечается удлинение времен релаксации и сужение линии ЯМР. Проведенные полуколичественные измерения времен релаксации в образцах с заменой низкомолекулярного декстрана на декстран с ММ 40 т свидетельствуют о существовании эффекта экранирования ядра нанокристалла магнетита звеньями полисахарида. При возрастании молекулярной массы происходит увеличение толщины оболочки наночастиц и возрастание стабильности суспензии. Лимитация подхода молекул воды к поверхности магнетита сказывается на уменьшении релаксационной эффективности оксида железа. Способность к гидратации гликозидных звеньев декстрана оставляет возможность диффузионного сближения молекул воды с магнетитом. Можно предполагать, что уменьшение релаксационной эффективности при возрастании толщины оболочки описывается диффузионными уравнениями с привлечением понятия микровязкости среды оболочечного слоя. Зарядовое состояние оболочки наночастицы не оказывает прямого воздействия на механизм релаксации магнитных частиц оксида железа, но вторичное воздействие за счет повышения агрегационной устойчивости может быть достаточно велико. Наночастицы, стабилизированные хитозаном, несут положительный заряд аминогрупп, который электростатически препятствует ассоциации частиц. Показано, что образование крупных ассоциатов ферримагнитных частиц оксида железа ведет к резкому возрастанию эффективного магнитного момента. Крупные ассоциаты допустимо аппроксимировать магнитными диполями, которые искажают постоянное магнитное поле. Появление градиента магнитного поля в масштабе 100 нм и выше вызывает сильное расхождение в значениях времен магнитной релаксации Т2 и Т2*, что и наблюдалось на опыте. В случае суспензий наночастиц оксида железа, стабилизирован-ных хитозаном, размерное распределение частиц смещено в сторону мелкодисперсной фазы, что приводит к ожидаемому сужению линии воды в спектрах ЯМР.
Выводы
1. Исследованы контрастирующие свойства нанодисперсных частиц оксида железа по критерию влияния наночастиц на магнитную релаксацию протонов воды
2. Показано, что при синтезе наночастиц оксида железа в форме магнетита происходит укорочение времен релаксации Т1,Т2, Т2*, которое пропорционально концентрации железа.
3. Окисленные формы наночастиц оксида железа утрачивают способность сильного сокращения времен релаксации воды.
4. Эффективность контрастирующего действия наночастиц оксида железа может быть охарактеризована параметром эффективной релаксирующей способности r.
5. Увеличение толщины оболочки наночастиц оксида железа, стабилизированных декстраном, незначительно уменьшает релаксационную эффективность магнетита в ядре за счет уменьшения вероятности диффузионных столкновений протонов воды с нанокристаллами магнетита.
6. Установлено преобладающее сокращение времен релаксации Т2* по сравнению с временами Т2 и Т1, что можно связать с механизмом неоднородного уширения линии в магнитно неоднородной среде.
7. Суспензии магнитных наночастиц оксида железа являются потенциальными контрастирующими средствами МРТ диагностики негативного контраста.
8. установлено, что к факторам, влияющим на способность магнитных наночастиц индуцировать уменьшение T2 *, относятся физические размеры частицы и ее оболочки, химические свойства оболочки и окружающей среды, движение частиц и протонов, и неоднородности в самих частицах. Выяснение влияния свойств оболочки на уменьшение Т2 * может обеспечить полезную основу для разработки более мощных контрастирующих оптимальных агентов для молекулярной МРТ.
