Лабораторная работа № 7

КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВОДОРАСТВОРИМОГО

БЕЛКА ФОТОКОЛОРИМЕТРИЧЕСКИМ МЕТОДОМ ЛОУРИ

Ц е л ь р а б о ты - определить содержание водорастворимого белка фотоколориметрическим методом Лоури.

Метод основан на биуретовой реакции и на цветной реакции тирозиновых остатков белковой молекулы с реактивом Фолина (окисление тирозина фосфорномолибденовольфрамовокислым натрием). Фотоколориметрирование сине-зеленых комплексов проводят при длине волны 750 нм, рабочей длине кюветы 0,5 см.

Углеводы, фенолы также взаимодействуют с реактивом Фолина.

Метод Лоури применяют для определения водо-, соле- и щелочерастворимых белков при фракционировании мышечных белков. Метод характеризуется высокой чувствительностью (10-100 мкг белка в пробе).

Оборудование, реактивы:

Фотоколориметр; кюветы; пробирки; пипетки; реактив А; реактив В;

реактив С; реактив Фолина-Чокальтеу.

Реактив А: 2%-й раствор карбоната натрия в 0,1 н растворе NaOH.

Реактив В: 0,5%-й раствор CuSO₄ в 1%-м растворе виннокислого натрия или калия Na₂C₄H₄O₆ в 25 мл воды. Растворы смешивают.

Реактив С: перед анализом смешивают 49 мл реактива А и 1 мл реактива В. Реактив годен в течение 1 дня.

Приготовление реактива Фолина-Чокальтеу (фенольного реактива):

в круглодонную колбу на 1,5-2 л вносят 100 г вольфрама натрия NaW_o4*2H₂O и 25 г молибдата натрия Na₂MoO_4*2H₂O,

растворяют все в 700 мл дистиллированной воды. К раствору добавляют 50 мл 80%-го раствора ортофосфорной кислоты H₃PO₄ и 100 мл концентрированной HCl.

К колбе присоединяют обратный холодильник и кипятят в течение 10 часов, далее прибавляют 150 г Li₂SO₄, 50 мл воды, 3-4 капли брома. Кипятят без холодильника 15 мин под тягой для удаления избытка брома.

Затем раствор охлаждают до комнатной температуры, доводят его объем до 1 л водой, фильтруют. Полученный раствор должен быть ярко-желтого цвета. Реактив следует хранить в темной склянке, перед употреблением разбавить дистиллированной водой 1:1. Определяют кислотность полученного реактива: разводят 10 раз и титруют 0,1 н раствором щелочи в присутствии фенолфталеина. Полученный реактив должен быть 0,1 н.

Порядок выполнения работы:

Помещают в пробирку 0,4 мл раствора белка, добавляют 2см реактива С.

Через 10 мин добавляют 0,2 мл реактива Фолина-Чокальтеу. Смесь тщательно перемешивают и выдерживают при комнатной температуре в течение 30 мин. Параллельно готовят контрольную пробу для сравнения. Фотоколориметрирование проводят при длине волны 750 нм. По калибровочному графику определяют содержание белка.

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 8