Фотоколориметрическим нингидриновым методом

Ц е л ь р а б о т ы - количественно определить аминный азот в растворах белков, полипептидов, олигопептидов, аминокислот фотоколориметрическим нингидриновым методом.

Метод основан на взаимодействии нингидрина с аминокислотами в слабокислой среде при рН = 5,0…5,5 с образованием дикетогидриндилидендикетогидринамина (ДИДА), окрашенного в сине-фиолетовый цвет (комплекс Руэмана). Фотоколориметрирование комплекса Руэмана проводят при длине волны 540 нм.

Оборудование, реактивы:

ФЭК; кюветы на 10 мм; баня водяная; пробирки; пипетки; колбы мерные на 100 мл; раствор аминокислот или белковый ацетатный буфер рН = 5,3…5,4;

нингидрин (1%-й раствор); этиловый спирт C₂H₅OH (90%-й); кислота соляная (0,1 н раствор); раствор аминокислоты стандартный (2,5_*10^-2 моль/л).

Для приготовления ацетатного буфера (рН = 5,5) смешивают 86 мл 0,2 М ацетата натрия и 14 мл 0,2 М раствора уксусной кислоты.

Порядок выполнения работы:

К 1 мл раствора белка или аминокислоты прибавляют 2 мл ацетатного буфера (рН = 5,5), 0,5 мл 1%-го водного раствора нингидрина. Пробирки накрывают фольгой и нагревают на водяной бане в течение 20 мин. Охлаждают до комнатной температуры, добавляют 3,5 мл этанола, наблюдается фиолетовая окраска. Через 5 мин проводят фотоколориметрирование пробы при длине волны 540 нм, рабочей длине кюветы 1 см. По калибровочной кривой определяют содержание аминного азота.

Построение калибровочного графика.

Для построения калибровочного графика готовят стандартный раствор лейцина концентрации 2,5_*10^-2 моль/л, что соответствует 35 мг аминного азота в 1 л. Для этого 328 мг лейцина помещают в мерную колбу на 100 мл и доводят до метки водой. В шесть пробирок вносят стандартный раствор лейцина и воду в соотношениях, указанных в табл. 9.

Таблица 9

Номер пробы	Объем,	мл	Содержание Аминного Азота
	вода	раствор лейцина	(мг/л)
	1,0		-
	0,9	0,1	0,035
	0,8	0,2	0,070
	0,7	0,3	0,105
	0,6	0,4	0,140
	0,5	0,6	0,175

В каждую пробирку с раствором лейцина добавляют по 2 мл ацетатного буфера (рН = 5,5), 0,5 мл раствора нингидрина. Содержимое пробирок перемешивают, пробирки нагревают на водяной бане в течение 20 мин, охлаждают, добавляют по 3,5 мл этанола в каждую - наблюдается появление фиолетовой окраски.Фотоколориметрирование проводят при длине волны 540 нм.