Обратная транскриптаза

При изучении ретровирусов, геном которых представлен молекулами одноцепочечной РНК, было обнаружено, что в процессе внутрикле­точного развития они проходят стадию интег­рации своего генома в виде двухцепочечной ДНК в хромосомы клетки-хозяина. В 1964 г. X. Темин выдвинул гипотезу о существовании вирусспецифичного фермента, способного син­тезировать на РНК-матрице комплементарную ДНК. В 1970 г. X. Темин и С. Мизутани, а также независимо от них Д. Балтимор открыли такой фермент в препарате внеклеточных вирионов вируса саркомы Рауса. Данная РНК-зависимая ДНК-полимераза получила название ревертаза (обратная транскриптаза).

Наиболее детально изучена ревертаза рет­ровирусов птиц. Каждый вирион содержит око­ло 50 молекул этого фермента. Обратная транскриптаза состоит из двух субъединиц - ά (65 кДа) и β (95 кДа), присутствующих в эквимолярном количестве. ά -Субъединица пред­ставляет собой N-концевую часть (две трети) β-субъединицы.

Обратная транскриптаза обладает по край­ней мере тремя ферментативными активнос­тями:

· ДНК-полимеразной, использующей в ка­честве матрицы как РНК, так и ДНК;

· активностью РНКазы Н, гидролизующей РНК в составе гибрида РНК-ДНК, но не одно- или двухцепочечную РНК;

· ДНК-эндонуклеазной.

Первые две активности необходимы для син­теза вирусной ДНК, а эндонуклеаза, по-видимому, важна для интеграции вирусной ДНК в ге­ном клетки-хозяина. β-Субъединица ревертазы обладает всеми тремя активностями, в то время как ά-субъединица - только полимеразной и РНКазы Н.

Очищенная обратная транскриптаза синте­зирует ДНК как на РНК-, так и на ДНК-мат­рицах. Чтобы начать синтез, ревертазе, как и другим полимеразам, необходим короткий двухцепочечный участок — праймер. Праймером может служить одноцепочечный сегмент как РНК, так и ДНК, которые в процессе реак­ции оказываются ковалентно связанными с новосинтезированной цепью ДНК.

Обратную транскриптазу преимущественно используют для транскрипции матричной РНК в комплементарную ДНК (кДНК). Реакцию об­ратной транскрипции проводят в присутствии сильных ингибиторов РНКазной активности. При этом удается получать полноразмерные ДНК-копии целевых молекул РНК. В качестве праймера при обратной транскрипции поли (А)-содержащих мРНК используют олигo(dT) (рис.), а для молекул РНК, не имею­щих 3'-поли (А)-концов, - химически синтези­рованные олигонуклеотнды, комплементарные 3'-концу изучаемой РНК. Кроме того, послед­ний тип молекул РНК можно перевести в поли(А)-содержащие с помощью поли(А)-полимеразы Е. coli.

После синтеза на мРНК комплементарной цепи ДНК и разрушения РНК (обычно приме­няют обработку щелочью) осуществляют син­тез второй цепи ДНК. При этом используют способность ревертазы образовывать на 3'-кон­цах одноцепочечных кДНК самокомплементар­ные шпильки, которые могут выполнять функ­ции праймера. Матрицей служит первая цепь кДНК. Данная реакция может катализироваться как ревертазой, так и ДНК-полимеразой I E. co­li. Сочетание этих двух ферментов позволяет повысить выход полноценных двухцепочечных молекул кДНК.

По окончании синтеза первая и вторая цепи кДНК остаются ковалентно связанными петлей шпильки, служившей праймером при синтезе второй цепи. Эту петлю расщепляют эндонуклеазой S1, специфически разрушающей одноцепочечные участки нуклеиновых кислот. Об­разующиеся при этом концы не всегда оказы­ваются тупыми, и для повышения эффектив­ности последующего клонирования их репарируют до тупых с помощью фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I E. coli. Полученную двухце­почечную кДНК можно затем встраивать в кло­нирующие векторы, размножать в составе гиб­ридных молекул ДНК и использовать для дальнейших исследований.