Определение массовой доли водорастворимых белковых

Веществ фотоколориметрическим методом Лоури

Метод основан на биуретовой реакции и на цветной реакции тирозиновых остатков белковой молекулы с реактивом Фолина (окисление тирозина фосфорномолибденовольфрамовокислым натрием). Фотоколориметрирование сине-зеленых комплексов проводят при длине волны 750 нм и рабочей длине кюветы 0,5 см. Углеводы и фенолы также взаимодействуют с реактивом Фолина. Метод Лоури применяют для определения водо-, соле- и щелочерастворимых белков при фракционировании мышечных белков. Метод характеризуется высокой чувствительностью (от 10 до 100мкг белка в пробе).

Оборудование и реактивы: фотоколориметр; кюветы; пробирки; пипетки; реактив А – 2 %-ный раствор карбоната натрия в 0,1 н растворе гидроксида натрия; реактив В – 0,5 %-ный раствор сернокислой меди в

1 %-ном растворе виннокислого натрия (Na₂C₄Н₄О₆) или калия в 25 см³ дистиллированной воды, растворы смешивают; реактив С – перед анализом смешивают 49 см³ реактива А и 1 см³ реактива В, реактив годен в течение 1 дня; реактив Фолина-Чокальтеу (фенольного реактива): в круглодонную колбу емкостью от 1,5 до 2 дм³ вносят 100 г вольфрамата натрия NaWo₄ · 2H₂O и 25 г молибдата натрия Na₂MoO₄ · 2H₂O растворяют все в 700 см³ дистиллированной воды, к раствору добавляют 50 см³ 80 %-ного раствора ортофосфорной кислоты Н₃РО₄ и 100 см³ концентрированной соляной кислоты НCl. К колбе присоединяют обратный холодильник и кипятят в течение 10 часов. Добавляют 150 г сульфата лития Li₂SO₄, 50 см³ воды, 3-4 капли брома и кипятят без холодильника 15 минут под тягой для удаления избытка брома. Затем раствор охлаждают до комнатной температуры, доводят его объем до 1 дм³ водой, фильтруют. Полученный раствор должен быть ярко-желтого цвета. Реактив следует хранить в темной склянке, перед употреблением разбавлять дистиллированной водой 1: 1. Определяют кислотность полученного реактива: разводят в 10 раз и титруют 0,1 н раствором щелочи в присутствии фенолфталеина. Полученный реактив должен быть 0,1 н.

Проведение анализа:

Помещают в пробирку 0,4 см³ раствора белка (водная вытяжка или раствор неизвестной концентрации), добавляют 2 см³ реактива С. Через 10 минут добавляют 0,2 см³ реактива Фолина-Чокальтеу. Смесь тщательно перемешивают и выдерживают при комнатной температуре в течение 30 минут. Параллельно готовят контрольную пробу для сравнения (0,4 см³ дистиллированной воды). Фотоколориметрирование проводят при длине волны 750 нм. По калибровочному графику определяют содержание белка.

Определение массовой доли белковых веществ макрометодом