Методы определения активности ферментов

Из-за низкой активности ферментов в биологических жидкостях, а также из-за трудности дифференциации различных ферментов химическим способом на практике не применяется химическое определение активности ферментов, а измеряется каталитический эффект ферментов путем измерения скорости реакции, при которой субстрат под действием фермента превращается в продукт реакции. Эта величина известна как «скорость реакции» и при определенных условиях прямо пропорциональна количеству присутствующего фермента.

По способу измерения различают: кинетическое измерение, двухточечное измерение, измерение по конечной точке. Преимущество кинетического измерения состоит в возможности прямого непрерывного измерения скорости ферментативной реакции в начальной линейной части кривой при оптимизированной концентрации реактивов. С этой точки зрения наиболее точными являются методы, основанные на оптическом тесте Варбурга. Принцип Варбурга основан на разнице спектрофотометрического поглощения при определенной длине волны (340 нм) восстановленной (NаDН) и окисленной (NаD) форм никотинамидеиннуклеотида. При длине волны 340 нм NаDН имеет максимальную абсорбцию, тогда как NаD не имеет поглощения при данной длине волны. Прямой оптический тест применяется для определения активности дегидрогеназ.

Фотометрические методы основаны на образовании окрашенных соединений с продуктами ферментативной реакции. Измерение проводят по конечной точке, что является недостатком методов этой группы, и точность их ниже, чем методов, основанных на оптическом тесте Варбурга. Исключение составляют методы, в которых в ходе реакции непосредственно из субстрата образуется окрашенное соединение.

Основным принципом ферментной диагностики является выбор оптимального спектра ферментов, изменение активности которых характерно для патологии определенных органов и тканей. Спектр ферментов для диагностики заболеваний некоторых органов:

· сердце – КК, ЛДГ, АСТ;

· скелетные мышцы – КК, АЛД;

· кости – ЩФ;

· кровь – ЛДГ 2, ЛДГ 3;

· поджелудочная железа – α-амилаза, липаза;

· предстательная железа – КФ;

· печень, желчные пути – АЛТ, ХЭ, ЩФ.

Метод определения аспартатаминотрансферазы (АСТ) с