2015-07-04
1981
В основе определения активности АСТ с динитрофенилгидразином лежит метод Райтмана-Френкеля. АСТ в присутствии а-кетоглютарата катализирует реакцию переаминирования L-аспартата с образованием оксалоацетата, который декарбоксилируется до пирувата.
Принцип метода: пируват с 2,4-динитрофенилгидразоном в щелочной среде образует динитрофенилгидразон, интенсивность окраски которого прямо пропорциональна активности АСТ и измеряется фотометрически при длине волны 500-560 нм.
Реагенты:
1. Реагент 1: субстратно-буферный раствор, рН 7,4, содержащий калий фосфорнокислый однозамещенный, 100 ммоль/л; ДL- аспартат 200 ммоль/л, α-кетоглютарат, 2 ммоль/л; динатриевую соль этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), 5 ммоль/л; азид натрия, 0,095 %.
2. Реагент 2: раствор, содержащий 2,4-динитрофенилгидразин, 1 ммоль/л; соляную кислоту, 1 моль/л.
3. Реагент 3: концентрированный раствор гидроокиси натрия, 4,0 моль9л
4. Реагент 4. калибровочный раствор пирувата натрия, 1 ммоль; азид натрия, 0,095%.
Ход определения: В мерную колбу на 1000 мл внести 100 мл реагента 3, довести объем до метки дистиллированной водой и перемешать.
|
|
|
В опытную, холостую и контрольную пробу на сыворотку добавить по 0,25 мл реагента 1. Инкубировать при температуре 37°С 5 минут, добавить в опытную 0,05 мл сыворотки крови, а в холостую 0,05 мл дистиллированной воды. Все перемешать и инкубировать при температуре 37°С точно 30 минут. Добавить реагент 2 в опытную, холостую и контрольную пробы по 0,25 мл, и в контрольную добавить сыворотку крови 0,05 мл. Перемешать и выдержать при комнатной температуре (20-25°С) в течение 20 минут, добавить во все пробирки по 2,5 мл щелочного раствора. Пробы перемешать и выдержать при комнатной температуре в течение 5 минут. Измерить оптические плотности опытной пробы (Е 1) и контрольной пробы на сыворотку (Е 2) против холостой пробы в кювете с длиной оптического пути 10 мм при длине волны 500-560 нм.
Для определения активности АСТ использовать разность оптических плотностей (Е) опытной пробы и контрольной пробы на сыворотку: Е= Е1 - Е2.
Расчет активности АСТ в сыворотке крови проводят по калибровочному графику. Для его выполнения берут 5 пробирок, в которые добавляют калибратор: 0,05 мл; 0,10 мл; 0,15 мл; 0,20 мл; 0,25 мл, дистиллированной воды во все по 0,1 мл, реагента 1 по 0,5 мл; 0,45 мл; 0,40 мл; 0,35 мл; 0,30 мл; 0,25 мл соответственно и реагента 2 по 0,5 мл во все пробирки.
После добавления реагента 2 пробы тщательно перемещать, выдержать при комнатной температуре в течение 20 минут, затем во все пробирки добавить по 5 мл щелочного раствора, тщательно перемещать. Выдержать при комнатной температуре в течение 5 минут. Измерить оптическую плотность раствора в пробирках против раствора дистиллированной воды - 0,1 мл, в которую добавлены реагенты 1 и 2 по 0,5 мл. Кювета на 10 мм оптического пути, длина волны 500-560 нм.
Построение калибровочного графика: на оси ординат откладывают оптическую плотность для каждой пробы, а на оси абсцисс – соответствующие им значения активности АСТ.
