Определение содержания церулоплазмина

Принцип реакции: реакция основана на том, что церулоплазмин (ЦП) окисляет диамины. Окисленный диамин, соединяясь с диметилпарафенилендиамином, дает розовое окрашивание, интенсивность которого пропорциональна ферментативной активности ЦП.

Реактивы: 1. 0,5 % раствор солянокислого парафенилендиамина (ПФД) в ацетатном буфере рН 5,2. 2. Ацетатный буфер рН 5,2: 20 мл ледяной уксусной кислоты и 163 г ацетата натрия (CH 3COONa: 3Н 2О) разводят в 1 л дистиллированной воды. 3. 0,25% раствор роданистого калия.

Ход определения. Опыт: к 1мл раствора ПФД прибавляют 0, 1 мл сыворотки, инкубируют 30 минут при 37 градусов, затем и нгибируют добавлением 5 мл роданистого калия и помещают пробирки в лед. Определяют оптическую плотность на ФЭК при длине 525 против контрольного опыта.

Для построения калибровочной кривой надо взять чистый препарат ЦП, сделать разведения от 0,05 до 1, 0 мг% и провести работу как в опыте.

2.4.3. Определение гемоглобина

Гемоглобин – основной дыхательный пигмент эритроцитов, относящийся к хромпротеидам и обеспечивающий ткани кислородом. Гемоглобин состоит из белка – глобина и гема – соединения протопорфирина 1Х с железом. Железо придает гемоглобину характерную окраску. Присоединение к гему различных химических групп сопровождается изменением окраски, на этом основано определение концентрации гемоглобина в крови.

Исследование содержания гемоглобина в крови включает определение гемоглобина и его дериватов, которые присутствуют в крови здоровых людей или появляются при различных патологических состояниях. У здоровых людей в крови гемоглобин находится в виде оксигемоглобина, восстановленного гемоглобина и в небольшом количестве – метгемоглобина, карбоксигемоглобина и вердоглобина.

Гемиглобинцианидный метод определения гемоглобина

Принцип. Гемоглобин окисляют в метгемоглобин железосинеродистым калием. Образующийся с ацетонциангидрином окрашенный цианметгемоглобин определяют колометрически.

Реактивы. 1. Трансформирующий раствор: ацетонциангидрин – 0, 5 мг; калий железосинеродистый – 0, 2 г; натрия гидрокарбонат – 1 г; дистиллированная вода – до 1 л. Раствор желтого цвета, прозрачный. При обесцвечивании или появлении осадка непригоден. 2. Калибровочный раствор гемиглобинцианида.

Ход определения. В пробирку к 5 мл трансформирующего раствора добавляют 0,02 мл крови (разведение в 251 раз), тщательно перемешивают и оставляют стоять на 10 минут. Измеряют на ФЭКе при длине волны 500- 560 нм (зеленый светофильтр) в кювете с толщиной слоя 1 см против холостой пробы. Измеряют при тех же условиях стандартный раствор.

Расчет содержания гемоглобина производят по калибровочному графику, построенному по стандартному раствору гемиглобинцианида, или по формуле:

Еоп

Нb (г%) = ------. С. К. 0,001,

Ест

Где Е оп – экстинкция опытной пробы, Ест –экстинкция стандартного раствора, С – концентрация гемиглобинцианида в стандартном растворе, мг%, К- коэффициент разведения крови, 0,001 – коэффициент для перерасчета мг/100 мл в г/ 100 мл.