Метод определения аланинаминотрансферразы (АЛТ) в

Сыворотке и плазме крови с динитрофенилгидразином

Принцип метода: в основе метода лежит метод Райтмана-Френкеля. В результате реакции переаминирования под действием АЛТ образуется пируват, который в щелочной среде образует с 2,4-динитрофенилгидразином окрашенный гидразон, поглощающий в области 500-560 нм (зеленый светофильтр). Концентрация образовавшегося гидразона пропорциональна активности АЛТ.

Реактивы:

1. Реагент 1: субстратно-буферная смесь, содержащая трис-буфер 50 ммоль/л, ЭДТА 5 ммоль/л; Д, L- аланин 200 ммоль/л, α-кетоглютарат 2 ммоль/л. Перенести в мерную колбу на 50 мл и довести дистиллированной водой до метки.

2. Реагент 2: раствор 2,4-динитрофенилгидразона 1 ммоль/л.

3. Реагент 3: концентрат щелочного раствора.

4. Калибратор. Раствор пирувата натрия 1 ммоль/л.

Ход определения: В опытную и холостую пробы внести по 0,25 мл реагента 1, выдержать при 37°С в течение 5 минут. В опытную пробирку внести 0,05 мл сыворотки, тщательно перемещать и инкубировать в течение 30 минут при 37°С. Затем внести в обе пробирки по 0,25 мл реагента 2 и в холостую пробу 0,05 мл сыворотки. Тщательно перемещать и выдержать в течение 20 минут при комнатной температуре. Затем внести по 2,5 мл в каждую пробирку реагента 3. Тщательно перемещать, выдержать в течение 5 минут при комнатной температуре и измерить при длине волны 500-560 нм (зеленый светофильтр) в кювете на 1 см против холостой пробы. Расчет активности фермента в сыворотке крови произвести по калибровочному графику.

Построение графика: из калибратора приготовить ряд разведений: в первую пробирку прилить 0,025 мл в следующие соответственно по 0,05 мл; 0,10 мл; 0,15 мл; 0,20 мл; 0,25 мл. Добавить воды с первой по пятую соответственно по: 0,325 мл; 0,3 мл; 0,25 мл; 0,2 мл; 0,15 мл; 0,1 мл. Добавить во все пробирки по 0,25 мл реагента 1. Тщательно перемещать и добавить 0,5 мл реагента 2, тщательно перемешать и выдержать при комнатной температуре в течение 20 минут. Затем добавить 5 мл реагента 3 и оставить для развития окраски.

Активность АЛТ в первой пробирке составляет: 9 Е/Л или 150 нмоль/л и в следующих соответственно: 18 Е/л, 37 Е/л, 56 Е/л, 77 Е/л, 92 Е/л или 300 нмоль/л, 617 нмоль/л, 934 нмоль/л, 1284 нмоль/л, 1534 нмоль/л.

Нормальные значения АЛТ в сыворотке крови человека не более 12 Е/л или 200 нмоль/л.