Унифицированный метод определения общего холестерина по реакции с хлорным железом (метод Златкис-Зака)

Принцип метода: Содержащийся в плазме или сыворотке крови свободный и эфирносвязанный холестерин окисляется хлорным железом в присутствии уксусной, серной и фосфорной кислот с образованием ненасыщенных продуктов, окрашенных в красно-фиолетовый цвет. Фосфорная кислота повышает стойкость реактива, содержащего хлорное железо.

Реактивы:

1. Ледяная уксусная кислота.

2. Серная кислота концентрированная.

3. Железо хлорное FeCI₃ х 6Н₂О.

4. Ортофосфорная кислота; содержит 85%-ный Н₃РО₄.

5. Раствор хлорного железа: 2,5 г хлорного железа растворяют в 80 мл ортофосфорной кислоты. Нагревая до полного растворения, затем охлаждают и доводят объем до 100 мл ортофосфорной кислотой.

6. Цветной реактив: к 8 мл раствора хлорного железа добавляют серную кислоту так, чтобы суммарный объем был 100 мл.

7. Калибровочный раствор холестерина в уксусной кислоте: 116 мг холестерина растворяют в 100 мл ледяной уксусной кислоты. Раствор содержит холестерин в концентрации 3 ммоль/л.

Ход определения: К 1,3 мл уксусной кислоты осторожно добавляют 0,05 мл плазмы или сыворотки крови без гемолиза, перемешивают, а затем добавляют 1 мл цветного реактива, хорошо перемешивают встряхиванием и оставляют на 30 мин при комнатной температуре, после чего фотометрируют при длине волны 530 нм в кювете с длиной оптического пути 1 см против холостого опыта, в который берут 1,3 мл уксусной кислоты, 0,05 мл исследуемой сыворотки или плазмы и 1 мл концентрированной серной кислоты.

Для приготовления калибровочного графика вместо исследуемого материала берут 0,05-0,2 мл калибровочного раствора, к которому добавляют уксусную кислоту до суммарного объема 1,35 мл, а затем добавляют 1 мл цветного реактива. Проба, в которую взяли 0,05 мл калибровочного реактива по окраске соответствует опытной пробе с содержанием холестерина в исследуемом материале 3 ммоль/л; проба, в которую взяли 0,1 мл калибровочного раствора, соответствует содержанию холестерина 6 ммоль/л и т.д. Расчет проводят по калибровочному графику.

Унифицированный метод определения триглицеридов по реакции с ацетилацетоном после экстракции смесью гептана и изопропилового

Спирта

Триглицериды или нейтральные жиры представляют собой эфиры глицерина и трех остатков жирных кислот, чаще всего с 16-18 атомами углерода. Точный состав жирно кислотных остатков может колебаться в определенных пределах и зависит от характера питания. Наибольшее значение имеет определение триглицеридов для типирования гиперлипидемий. Кроме того повышенное содержание триглицеридов бывает при нефротическом синдроме, гипотиреозе. Количество триглицеридов определяют по содержанию глицерина, который образуется при щелочном или ферментативном гидролизе.

Принцип метода: Триглицериды экстрагируются смесью гептана и изопропилового спирта,в которую переходят только неполярные липиды, а более полярные фосфолипиды остаются в водной фазе. Триглицериды омыляются (гидролизуются) щелочью, глицерин окисляется йодной кислотой до формальдегида, который определяется по цветной реакции с ацетилацетоном.

Реактивы:

1. Гептан.

2. Изопропиловый спирт.

3. 0,08Н серная кислота (примерно 2,2 мл концентрированной Н₂SO₄ на 1 воды.

4. Едкое кали, 6,25 моль/л: 17,8 г КОN растворяют в 50 мл воды.

5. Уксусная кислота, 50 г/л.

6. Йодная кислота: растворяют 0,6 г HIO₄х2Н₂О (перйодная кислота) в 100 мл 5%-ной уксусной кислоты.

7. Аммония ацетат 2 моль/л: растворяют 154 г ацетата аммония в воде, объем доводят до 1 л.

8. Ацетилацетоновый реактив: 1,5 мл ацетилацетона разводят раствором уксуснокислого аммония до суммарного объема 200 мл.

9. Калибровочный раствор треолеина, 2 ммоль/л. Содержит 170 мг триолеина в 100 мл изопропилового спирта.

Ход определения: К 0,5 мл сыворотки или плазмы добавляют 2 мл гептана, 3,5 мл изопропилового спирта и 1 мл 0,08Н серной кислоты, перемешивают и через 5 мин центрифугируют. Из верхнего (гептанового) слоя отбирают 0,4 мл, добавляют 2 мл изопропилового спирта и 1 каплю 6,25Н КОН. Перемешивают, нагревают на водяной бане 10 мин при 70°С. После охлаждения добавляют 0,2 мл перйодатного реактива и 1 мл ацетил ацетонового реактива, после перемешивания вновь нагревают 10 мин при 70°С. Развивается желто-зеленое окрашивание, интенсивность которого измеряют при длине волны 425 нм в кюветах с длиной оптического пути 0,5 см против холостой пробы, которую ставят так же, как и опытную, но вместо исследуемого материала берут 0,5 мл воды.

Калибровочную пробу ставят так же, как и опытную, но вместо сыворотки или плазмы берут 0,5 мл калибровочного раствора и 0,5 мл воды: развивающаяся окраска соответствует окраске опытной пробы, в которую взята плазма с содержанием триглицеридов 2 ммоль/л.

Нормальные величины триглицеридов в плазме крови считают 0,55-1,65 ммоль/л (50-150 мг в 100 мл).