Фракционирование липопротеидов в полиакриламидном геле

Липопротеиды плазмы крови являются транспортной формой липидов в организме человека. Они транспортируют экзогенные и эндогенные липиды. Отдельные липопротеиды осуществляют захват избыточного холестерина из стенок периферических тканей и осуществляют его обратный транспорт в желчные кислоты

Плазменные липопротеины (ЛП) – это сложные комплексные соединения, имеющие характерное строение: внутри липопротеиновой частицы находится жировая капля (ядро), содержащая неполярные липиды (триглицериды, эстерифицированный холестерин); жировая капля окружена оболочкой, в состав которой входят фосфолипиды, белок и свободный холестерин. Толщина наружной оболочки липопротеиновой частицы составляет 2,1 -–2, 2 нм, что соответствует половине толщины липидного бислоя клеточных мембран. Плазменные ЛП представляют собой сложные надмолекулярные комплексы, в которых химические связи между компонентами комплекса носят нековалентный характер, поэтому их называют не молекулой, а частицей.

Белки, расположенные на поверхности липопротеинов, называют апопротеинами или просто апо. Апопротеины – это коферменты, активаторы ферментов, обеспечивающих метаболизм холестерина и триглицеридов. Эти белки обозначают буквами латинского алфавита (А, В, С, Е и др.). Для каждого липопротеида специфична его белковая часть, она и определяет свойства комплекса в целом и его значение. Липидная часть менее специфична, так как разные липопротеиды содержат одни и те же липидные вещества, но в разных соотношениях.

Существует несколько классификаций ЛП, основанных на различиях в их свойствах: гидратированной плотности, скорости флотации, электрофоретической подвижности, а также на различиях в апопротеиновом составе частиц. При ультрацентрифугировании в солевых растворах можно получить отдельные фракции ЛП: хиломикроны (ХМ) – самые легкие частицы, затем липопротеины очень низкой плотности (ЛПОНП), липопротеины низкой плотности (ЛПНП) и липопротеины высокой плотности (ЛПВП).

В основе другой классификации ЛП – по различиям электрофоретической подвижности по отношению к глобулинам плазмы крови, выделяют ХМ, пре бетта – ЛП, что соответствует подвижности ЛПОНП, бетта - ЛП, что соответствует ЛПНП, альфа – ЛП, что соответствует ЛПВП. В состав ЛПВП входят два главных белка А –1 и А – 11. Основным апобелком ЛПНП является апобелок В, он входит также в состав ЛПОНП и хиломикронов. Апобелки С – 1, С- 11 и С- 111 представляют собой небольшие полипептиды, которые могут свободно переходить от одного липопротеина к другому и тем самым меняется специализация ЛП.

ХМ – самая крупная липопротеиновая частица с очень низкой плотностью, богатая триглицеридами, содержит до 90% эндогенных триглицеридов, фосфолипидов 6%, холестерина 2% и только 1% белка, в основном апо А и апо С. Образуются после всасывания продуктов, обогащенных жиром в стенке кишечника и осуществляют транспортную функцию – перенос липидов к тканям, нуждающимся в них, а также служат для отложения запаса в подкожной жировой клетчатке. ХМ поступают в кровь через лимфатические сосуды. В норме из крови исчезают через 8-12 часов после приема пищи.

ЛПОНП – это широкий спектр частиц различающихся размером. Содержат больше белка – 9 %, это апо-В, апо-С, апо-Е, и до 91 % липидов, в состав которых входят: фосфолипиды – 14 - 20%, холестерин – 15 - 17%, триглицериды – 50 до 70%. Они также осуществляют транспортную функцию жиров к месту утилизации, но в основном это триглицериды эндогенного происхождения, которые синтезируются в слизистой оболочке кишечной стенки, но главным образом – в печени. У ЛПОНП по сравнению с ХМ существенно повышено содержание холестерина. Период полужизни ЛПОНП от 2до 4 часов, их расщепление происходит при действии липолитических ферментов.

ЛПНП – содержат в своем составе 21% белка и 70% липидов,в составе липидов: триглицеридов – от 8 до 33 %, фосфолипидов от 10 до 30 % и общего холестерина от 25 до 48 %. Таким образом в этом классе превалирует холестерин, в связи с этим ЛПНП имеют наибольшее отношение к атерогенезу В их составе белки: апо-В, апо-С, апо-Д, апо-Е, апо-А, апо-F. Образуются ЛПНП в печени, а также в результате метаболизма их предшественников, то есть ЛПОНП. Все клетки организма способны синтезировать ХС сами, но при невозможности обеспечить себя им получают его через ЛПНП и в меньшей степени от ЛПОНП. При необходимости невостребованный ХС вместе с этими липопротеидами вновь возвращается в печень, где он идет на образование желчных кислот. Период полужизни ЛПНП от 2 до 4 суток, расщепление происходит в надпочечниках, печени, селезенке, половых железах, а также в других органах.

ЛПВП – богаты белками, содержат 52%, в основном апо-А 1, апо-А 11, апо-С. липидов приблизительно 48%, из которых наибольшее количество относится к группе фосфолипидов – до 40%, на долю ТГ приходится примерно 5%, ХС – от 20 до 35%. Образование ЛПВП происходит в печени, в плазме крови синтез может происходить за счет расщепления предшествующих классов ЛП, то есть из ХМ и ЛПОНП. Частицы ЛПВП после возникновения имеют дисковидную форму, снаружи покрыты апо-белками, внутри двойной слой фосфолипидов. Вид и размер частиц зависит от количества молекул апо-А 1 на их поверхности. Во время нахождения в кровотоке эти частицы накапливают внутри себя холестерин. Апо-А 1 активирует сывороточный фермент лецитинхолестеринацетилтрансферразу, которая катализирует расщепление фосфолипидов и, ацетилируя холестерин, переводит его в биологически неактивную форму. Поэтому считают, что основная роль ЛПВП связана со способностью убирать избыточный ХС с наружной поверхности тех липопротеидов, которые обогащены им, а также из различных органов и тканей, нуждающихся в освобождении от холестерина для обратного транспорта данного ХС в печень, где он подвергается окислению. Таким образом, ЛПВП обладает антиатерогенным эффектом. Чем выше уровень ЛПВП, тем быстрее происходит липолиз ЛПОНП и частота развития атеросклероза, заболеваемость ИБС и другими ишемическими формами снижена, поэтому ЛПВП рассматриваются как фактор, способствующий здоровью и долголетию..

Помимо этих классов липопротеидов выделяют еще ЛППП (промежуточной) плотности, они образуются в плазме крови в качестве промежуточных комплексов на пути превращения ЛПОНП в ЛПНП. ЛППП относительно богаты не только холестерином, но и триглицеридами.

Принцип метода: Предварительно окрашенные липопротеиды сыворотки крови подвергают электрофорезу в направлении сверху вниз в колонке, заполненной слоями полиакриламидного геля (ПААГ). Нижний слой геля самый мелкопористый, верхний самый крупнопористый. Липопротеиды в зависимости от размера их молекул задерживаются в разных участках геля.

Реактивы:

1. ТРИС (оксиметил) аминометан.

2. Акриламид.

3. Метиленбисакриламид.

4. ТЕМЕД.

5. Рибофлавин.

6. Сахароза.

7. Глицин.

8. Судан черный – насыщенный спиртовый раствор.

9. Аммония персульфат. 0,14 %-ный раствор.

10. Электродный трисглициновый буфер, рН 8,3: в 1 л воды растворяют 0,6 г ТРИС и 2,88 г глицина; с помощью HCI или едкого натра устанавливают рН.

11. Трис- буфер рН 8,9 – раствор А: к 36,6 г ТРИС добавляют около 40 мл воды, 48 мл 1Н HCI и 0,23 мл ТЕМЕД; после растворения объем доводят до 100 мл водой и устанавливают рН 8,9.

12. Трис – буфер рН 6,7, раствор В: к 5,98 г ТРИС добавляют около 40 мл воды, 48 мл 1Н HCI и 0,46 мл ТЕМЕД, доводят объем до 100 мл и устанавливают рН 6,7.

13. 28%-ный раствор акриламида – реактив С: 28 г акриламида и 0,735 г метиленбисакриламида растворяют в воде и доводят объем до 100 мл.

14. 10%-ный раствор акриламида – реактив Д: 10 г акриламида и 2,5 г метиленбисакриламида растворяют в воде и объем доводят до 100 мл.

15. Раствор рибофлавина - реактив Е: 4 мг рибофлавина растворяют в 100 мл воды.

16. 40%-ный раствор сахарозы – реактив F: 40 г сахарозы растворяют в воде и доводят объем до 100 мл.

Ход определения: Определение проводят в аппарате для вертикального электрофореза. Формируют столбики четырехслойного геля:

· нижний 10%-ный гель: раствор А –1 мл, С- 2,8 мл, аммония персульфат – 4 мл, воды – 0,2 мл.

· второй снизу 5%-ный гель: раствор А - 1 мл, раствор С –1,36 мл, аммония персульфат – 4 мл, воды – 1,64 мл.

· третий снизу 3%-ный гель: раствор А - 1 мл, раствор Д – 2 мл, раствор Е – 1 мл, раствор F – 4 мл.

· верхний 3%-ный гель: раствор В –1 мл, раствор Д - 2 мл, раствор Е - 1 мл, раствор F – 4 мл.

После того как залит очередной раствор, который должен полимеризоваться в гель, на него сверху наносят несколько капель воды, под слоем которого гель полимеризуется.

К 0,3 мл исследуемой сыворотки добавляют 0,15 мл раствора судана черного, 0,15 мл раствора сахарозы и 0,05 мл трис-буфера (рН 6,7), после чего перемешивают и оставляют на 1 час. Затем 0,03-0,05 мл осторожно наносят на поверхность сформированного геля, дают впитаться в течение нескольких минут и проводят электрофорез в течение 1 ч. При силе тока 4-5 мА на трубку.

Оценка результатов. На самом верху трубки расположена полоса хиломикронов, затем пре В липопротеиды, В-липопротеиды и α- липопротеиды.