Ннолошн

ИВ.Березин

НЛ.Клячко

АВ.Левашов

К.Мартинек

ВВМожаев

Ю.Л.Хмельницкий

ИММОБИЛИЗОВАННЫЕ ФЕРМЕНТЫ

, *\ т • ^|«1«1, t

•*.•

. • *_. •

•*.*•-»

i *•■*••*•

•Л *Л-'Л:"*"««*

. • •. *

■■■■>•■

-■£■■*■

г

<■•••*»*•■

ШОТЕННОЛОШН

ел

UIUDUDHH3iDng

в8-микнигах

ШОТЕННОЛОШР!

ПодредакциейНСЕгорова

ВДСамуилова

И.В.Березйн|

HJ1.Клячко

АВЛевашов

КМартинек

ВЯМожаев

ЮЛХмельницкий

Москва «Высшая школа» 1987

^МОБИЛИЗОВАННЫЕ ФЕРМЕНТЫ

ББК 30.6 Б63

УДК 574.6

Рецензенты:

кафедра биотехнологии микробного синтеза Московского технологиче­ского института пищевой промышленности (зав- кафедрой проф. Кан-тере В. М_г) и д-р техн. наук Попов В. Г. (ПО *Биопрепарат»)

ю Министерством высшего и среднего специального образо­вания СССР в качество учебного пособия для студентов биологических специальностей высших учебных заведений.

Биотехнология: Учеб. пособие для вузов. В 8 кн./Под Б63 ред. Н. С. Егорова В. Д. Самуи лова. Кн. 7: Иммобили­зованные ферменты/ [И, В. Ьсрезин|, Н. Л. Клнчко, А. В. Ле­вашов и др. — М.: Высш. шк., 1987. 159 — с.: ил.

Рассмотрены неорганические и органические носители (пилложки), хими­ческие к физические способы связывания белков (ферментов)- Проанализиро­ваны ки нети ко термодинамически особенности катализа иммобилизованными ферментами, их стабильность и другие физнко-кимичес&не свойства.

2010000000(4309000000) 510 ББК 30.6 + 28.07

Б--------------------------------------- КБ—53—9—86 iinz.

001 (01)-87 ^

© Издательство «Высшая школа», 1987

ПРЕДИСЛОВИЕ

В последние 10—15 лет на стыке ряда химических и биологи­ческих дисциплин сформировалось новое научно-инженерное на­правление — химическая энзимология. Стремительное развитие химической энзимологии обусловлено созданием нового типа ге­терогенных биоорганических катализаторов — иммобилизован­ных ферментов. Целесообразность исследований в этом направ­лении и важность внедрения иммобилизованных ферментов в практику подчеркнуты постановлением ЦК КПСС и Совета Ми­нистров СССР «О дальнейшем развитии физико-химической био­логии и биотехнологии и использовании их достижений в меди­цине, сельском хозяйстве и промышленности» (1981), а также в последующих постановлениях.

Проблема создания промышленных образцов иммобилизо­ванных ферментов объединяет необычайно широкий круг спе­циалистов самого разного профиля. Это, в свою очередь, ставит перед высшей школой задачу подготовки таких специалистов.

К настоящему времени в мировой и советской научной ли­тературе имеются десятки обзоров, сборников и монографий, посвященных получению, свойствам и использованию иммобили­зованных ферментов. Однако, как правило, эти издания рассчи­таны на узкий круг специалистов, имеющих соответствующее образование в области физической химии ферментов или инже­нерной энзимологии. Учебных пособий для более широкой ауди­тории в отечественной литературе нет.

Цель настоящего учебного издания состоит в том, чтобы по возможности в общедоступной форме рассмотреть современное состояние проблемы иммобилизованных ферментов, наметить пу­ти решения ее ключевых вопросов и дать верную ориентацию в этой области,

В составлении настоящего учебного пособия принимали учас­тие И. В. Березин (предисловие, введение, заключение), Н. Л. Клячко (гл. I, VI), А. В. Левашов (гл. III), 1С Мартинек (предисловие, введение, заключение), В. В, Можаев (гл. IV, V, VI), Ю. Л. Хмельницкий (гл. II). Редактирование этой книги проведено И. В. Берез иным и А. В, Левашовым.

Авторы выражают глубокую благодарность рецензентам: Д-ру техн. наук В. Г. Попову и кафедре биотехнологии микробного синтеза Московского ордена Трудового Красного знамени тех­нологического института пищевой промышленности (зав, кафед­рой проф. В. М. Кантере) за ценные замечания и советы.

Авторы

ВВЕДЕНИЕ

Ферменты и ферментативные системы традиционно приме­няются в самых различных областях практической деятельности: в пищевой_, фармацевтической, текстильной, кожевенной и других отраслях промышленности, в медицине, сельском хозяйстве, орга­ническом синтезе, химическом анализе и т. д. Тем не менее раз­витие прикладной энзимологии долгое время сдерживалось доро­говизной или полным отсутствием на мировом рынке нужных ферментов, особенно их чистых препаратов. Очевидно, можно ожидать в недалеком будущем благодаря успехам микробиоло­гии коренного решения вопроса производства соответствующих ферментов в достаточном количестве.

Возможности применения ферментов осложнены, кроме того, еще, по крайней мере, двумя причинами. Во-первых, ферменты неустойчивы при хранении, а также при различных воздействиях, особенно тепловых. Во-вторых, многократное использование фер­ментов затруднено из-за сложности их отделения от реагентов и продуктов реакции. По этим причинам практическое использо­вание ферментов могло быть ограничено, но уже на сегодняшний день найдены пути решения и этих проблем.

Принципиально новые перспективы открылись перед приклад­ной энзимологией в результате создания иммобилизованных фер­ментов, Дж, Нельсон и Е. Гриффин еще в 1916 г. показали, что инвертаза, адсорбированная на угле (т. е. иммобилизован­ная), сохраняет каталитическую активность. В 20—30-х годах работы по изучению адсорбции белков и ферментов были про­должены, однако исследования этого периода представляли глав­ным образом академический интерес и не преследовали практи­ческих целей. В 1939 г. Дж. Пфанмюллер и Г. Шлейх получили первый патент на применение адсорбированных на древесных опилках протеолитических ферментов для обработки шкур. Прин­ципиально важный шаг в направлении создания прочных конъюгатов ферментов с носителями был сделан в 1953 г. Н. Грубхофером и Д. Шлейтом. впервые применившими метод ковалентного связывания.

Для исследований 50—60-х годов характерна уже достаточно четкая осознанность практической значимости развиваемого на­правления. Немалая заслуга в этом принадлежит группам

Г. Манеке и Э. Канальского. В результате связывания фермента на носителе были созданы гетерогенные катализаторы, для кото­рых на первой конференции по инженер­ной энзимологии в Хенникере (США) в 1971 г., был узаконен термин «иммобилизованные ферменты». В литературе все еще встречаются и другие термины, например «нерастворимые фер­менты», «матрицированные ферменты» и т. п., смысл которых достаточно конкретен: ими обозначают препараты ферментон, связанных на нерастворимых носителях. Однако понятие «иммо­билизация* можно и нужно понимать шире, а именно, как любое ограничение свободы движения белковых молекул (или их фраг­ментов!) в пространстве. Помимо связывания с нерастворимым носителем этого можно также достичь, например, путем внутри­молекулярной или межмолекулярной «сшивки» белковых молекул низкомолекулйрными бифункциональными реагентами или же присоединением фермента к растворимому полимеру. Такие пре­параты иногда называют ферментами, модифицированными «сшивающими» или, соответственно, полимерными реагентами.

Иммобилизованные ферментные препараты обладают рядом существенных преимуществ при использовании их в прикладных целях по сравнению с нативными предшественниками. Во-пер­вых» гетерогенный катализатор легко отделить от реакционной среды, что дает возможность: а) остановить в нужный момент реакцию; б) использовать катализатор повторно; в) получать продукт, не загрязненный ферментом. Последнее особенно важно в ряде пищевых и фармацевтических производств.

Во-вторых, использование гетерогенных катализаторов поз­воляет проводить ферментативный процесс непрерывно* напри­мер в проточных колоннах, и регулировать скорость катализи­руемой реакции, а также выход продукта путем изменения ско­рости потока.

В-третьих, иммобилизация или модификация фермента спо­собствует целенаправленному изменению свойств катализатора, в том числе его специфичности (особенно в отношении к макро-молекулярным субстратам), зависимости каталитической актив­ности от рН> ионного состава и других параметров среды и, что очень важно, его стабильности по отношению к различного рода денатурирующим воздействиям. Отметим» что крупный вклад в разработку общих принципов стабилизации ферментов был сде­лан советскими исследователями.

В-четвертых, иммобилизация ферментов дает возможность регулировать их каталитическую активность путем изменения свойств носителя под действием некоторых физических факто­ров, таких, как свет или звук. На этой основе создаются механо-и зву ко чувствительные датчики, усилители слабых сигналов и бессеребряные фотографические процессы.

В результате внедрения нового класса биоорганических ката­лизаторов— иммобилизованных ферментов» перед прикладной энзимологией открылись новые, ранее недоступные пути разви-

тия. Одно лишь перечисление областей, в которых находят при­менение иммобилизованные ферменты, могло бы занять немало места. Однако в этом нет необходимости, поскольку прикладным аспектам и достижениям инженерной энзимологии целиком по­священа книга 8 серии «Биотехнология». Здесь важно лишь от­метить, что успех практического использования препаратов им­мобилизованных ферментов в значительной степени определяется подготовительным этапом работы — выбором подходящего носи* теля и метода иммобилизации, а также знанием кинетико-термо-динамических особенностей катализа иммобилизованными фер­ментами. Именно рассмотрению этого круга вопросов посвящено данное учебное пособие. Кроме того, уделено внимание пробле­мам стабильности ферментов вообще и иммобилизованных в частности, а также сформулированы общие принципы стабилиза­ции. Специальная глава отведена способам регенерации компо­нентов систем с иммобилизованными ферментами.

Глава

НОСИТЕЛИ

ДЛЯИММОБИЛИЗАЦИИ

ФЕРМЕНТОВ

Для получения иммобилизованных ферментов используется огромное число носителей, как органических, так и неорганиче­ских. Основные требования, предъявляемые к материалам, кото­рые могут быть применены для иммобилизации ферментов, сле­дующие (Дж. Порат, 1974): 1 —высокая химическая и биологи­ческая стойкость; 2 — высокая механическая прочность (в пер­вую очередь» по отношению к истиранию); 3 — достаточная про­ницаемость для фермента и субстратов, большая удельная по-верхность, высокая вместимость, пористость; А — возможность получения в виде удобных в технологическом отношении форм (гранул, мембран» труб, листов и т. д.); 5 — легкое переведение в реакционноспособную форму (активация); б — высокая гидро-фильность, обеспечивающая возможность проведения реакции связывания фермента с носителем в водной среде; 7 -■ невысо­кая стоимость. Отсутствие носителей, удовлетворяющих одно­временно всем этим требованиям, и разнообразие задач, стоя­щих перед экспериментаторами, обусловливают широкий набор применяемых для иммобилизации материалов.