Иммобилизация на (или в) носителе, как правило» создает

(26

вокруг молекул фермента стерические ограничения, т. е- как бы экранирует их от внешнего раствора. Это приводит к сущест­венному ограничению диффузии молекул других_т не связанных с носителем ферментов, в частности протеаэ, фосфорилаз, фос­фата з. Поэтому для иммобилизованных ферментов практически сведены на нет такие инактивационные процессы, как протеолиз_т микробное заражение и фосфоршшрование.

Иммобилизованные белки стабильнее нативных по отношению к инактивации в потоке. Причина заключается в том, что носи­тель механически защищает молекулы ферментов от деформа­ции в потоке, выполняя роль своеобразного демпфера.

В последние годы активно развиваются методы иммобили­зации, позволяющие ковалентно пришивать молекулу кофактора в районе активного центра фермента или совместно иммобилизо­вать молекулы кофактора н фермента на одном носителе в не­посредственной близости друг от друга. С помощью таких ме­тодических приемов становится возможным подавить таком ннак-тивационный механизм, как десорбция кофактора из активного центра фермента.

Наиболее сложная задача — затормозить химические изме­нения в белке, приводящие к инактивации. Однако и в этой области имеются положительные примеры использования иммо­билизации.

В тех случаях, когда инактивация происходит под действием пероксида водорода или супероксидных радикалов, хорошо за-рекомендовал себя следующий прием. Подвергающийся инактива­ции белок иммобилизуют совместно с каталазой или супероксид-дисмутазой — ферментами, катализирующими разложение, соответственно, НэОа и OjT

Как уже говорилось, некоторые ферменты инактивируются вследствие окисления кислородом воздуха высокореакштнно-способных функциональных групп их активного центра и в пер­вую очередь SH-групп. Такую инактивацию также удается подавить методами иммобилизации. Для этого фермент иммоби­лизуют в полиэлектролитной матрице, обладающей способностью «высаливать» кислород. В результате фермент экранирован от контакта с инактиватором и стабильность его по отношению к окислению становится существенно выше, чем у неиммоби-лизованного,

Кроме того, можно создать условия для конкуренции за вещество-инактиватор. Например* многие ферменты, имеющие SH-группы, необходимые для катализа, ннактивируются в ре­зультате их «отравления» катионами тяжелых металлов по ме­ханизму образования меркаптидов. Иммобилизуя такой фермент с другим белком с высоким содержанием реакцией неспособных SH-групп или пришивая к матрице носителя низкомолекулярные тнолы, добиваются того, что основная часть катионов металлов расходуется не на «отравление» фермента, а на модификацию SH-rpynn «несущественного» белка или тиола.

§ 4. Подавление с помощью иммобилизации первичных обратимых стадий денатурации и диссоциации матнвных белков

Как уже отмечалось, практически любой инактивационный процесс начинается с обратимой стадии [N^TD на схеме (1)]. Ее молекулярный механизм сводится либо к обратимому конфор-мацнонному изменению (обратимая денатурация), либо, в случае олигомерных белков, к обратимой диссоциации на субъединицы. В этом случае стабилизация ферментов состоит в том, чтобы подавить первую стадию.

На основе подобных представлений разработан ряд общих принципов, следуя которым можно в сотни и тысячи раз замед­лить необратимую инактивацию большого числа различающихся по структуре и функции ферментов. В результате стало возмож­ным проводить целенаправленный поиск конкретных путей стаби­лизации как мономерных белков, так и ферментов с четвертич­ной структурой, используемых в биотехнологии.

Наибольшие успехи в стабилизации ферментов связаны с применением метода иммобилизации. В общем случае можно указать по крайней мере три причины изменения стабильности в результате иммобилизации: 1) изменение конформации им­мобилизованного фермента по сравнению с нативной структурой; 2) изменение микроокружения ферментной молекулы; 3) ужест-ченне нативной конформации белковой глобулы. Первые два фактора, по-видимому, нельзя положить в основу разработки общих методов стабилизации ферментов. Дело в том_т что вопрос о связи стабильности белков с изменением их конформации и микроокружения является малоизученным. Более того, такая связь (даже если ее удастся установить) индивидуальна для каждого фермента. Поэтому для целенаправленной стабилиза­ции ферментов гораздо более перспективным представляется третий путь — ужестчение (закрепление) нативной конформации фермента с целью воспрепятствовать ее разворачиванию. Сле­дует отметить, что этот подход (увеличение жесткости белков) широко используется природой при создании стабильных белков термофильных микроорганизмов, живущих при повышенных температурах (50°С и выше).

Многоточечное не ко валентное взаимодействие фермента с носителем. В принципе белковые молекулы могут связываться с теми носителями, на поверхности которых имеются заряжен­ные, гидрофобные, полярные группы, за счет относительно сла­бых электростатических и гидрофобных взаимодействий, водо­родных связей. Однако, поскольку эти связи слабые, они прак тически не обрузуются в разбавленных растворах полимерных носителей. Дело в том, что большие потери энтропии, происходя­щие при образовании комплекса белок — носитель вследствие «за­мораживания» поступательного и вращательного движения моле-