Реактивация инактивированных ферментов

С точки зрения эффективности применения биокатализаторов было бы крайне заманчиво не только повысить стабильность ферментов, но и научиться возвращать активность отработан­ным в ходе технологического процесса ферментативным препа­ратам.

Практически одновременно с обнаружением феномена инак­тивации ферментов (начало XX в.) исследователи стали пред­принимать попытки их реактивации. К настоящему времени накоплено довольно много положительных примеров в этом направлении. Их удобно классифицировать согласно причинам, вызывающим инактивацию.

Реактивация агрегированных белков. Ее часто удается осу­ществить, разрушив межмолекулярные нековалентные контакты (гидрофобные, электростатические, водородные связи). Для этого используют те же денатуранты, которые разрушают не-ковалентные взаимодействия в нативных белках, вызывая их обратимую денатурацию: концентрированные растворы моче­вины и гуанидинхлорида, экстремальные значения рН и т. п.

Если образование агрегатов сопровождалось ковйлентным сшиванием отдельных глобул между собой S—S-связями, то эти связи необходимо разрушить. Это достигается при действии относительно невысоких концентраций (порядка мкмолъ/л) тиол-содержащих реагентов: цистеияа или дитиотреитола; в этих усло­виях, как правило, не затрагиваются внутримолекулярные S—S-связи в белке. Если при образовании ковалентных агрега­тов большую роль сыграли и нековалентные взаимодействия, то действие тиолов дополняется высокими концентрациями денату-рантов типа мочевины.

Реактивация белков с измененной первичной структурой. Если белок потерял активность в результате химической мо­дификации функциональных групи, то можно попытаться реак­тивировать его с помощью обратной химической реакции. Фер­менты, инактивированные путем модификации SH-групп (на­пример, их окислением), иногда удается реактивировать, добав­ляя избыток низкомолекулярного тиол а или другого восстано­вителя.

Если под действием тиол а в белке были разрушены S—S-связи, что привело к его инактивации, а образовавшиеся SH-группы провзанмодействовали с получением смешанных с тиолом дисульфидов, то такие ферменты иногда можно реак­тивировать, добавляя другие тнолы или ионы металлов. Меха­низм реактивации заключается в расщеплении смешанного дисульфида и последующем образовании «правильной» S—S-связн.

В литературе пока практически отсутствуют примеры удач­ной реактивации белков, инактивация которых явилась след­ствием таких химических процессов, как гидролиз пептидных связей, фосфор или рование, дезамидирование остатков аспара-гина.

Десорбция ииактивированного белка со стенок реакционного сосуда. Как уже отмечалось, «шрбционнан инактивация» бел­ков обусловлена слабыми нековалентными взаимодействиями (электрическими, гидрофобными, водородными связями) между белком и поверхностью реакционной ячейки. Реактивация в этом случае достигается за счет разрушения неспецифических взаимодействий при экстремальных значениях рН, под дей­ствием концентрированных растворов мочевины или гуанидин-хлорида и других реагентов, являющихся «обратимыми денату-рантами» для большинства белков.

Реактивация «необратимо денатурированных» ферментов. Реактивацию удается провести, руководствуясь следующей двух-стадийной схемой (рис. 25): сначала в инактивированном бел­ке следует разрушить все, в том числе ненативные нековалент­ные взаимодействия, т. е. перевести белок в развернутое состоя­ние и уже из этого состояния попытаться свернуть его в на-тивную конформацию. Таким образом, в общем случае задача о реактивации какого-либо «необратимо денатурированного* фер-

т

НЕОБРАТИМО

ВАННЫЙ IT

SH

Рис. 25, Схематическое изображение цикла: термом нактнвацня — реактивация фермента, а - разворачивание термоинактниирован-ного фермента с одновременным расщеплением S—S-связей; б — последующее сворачивание фермента в каталитически активную кон-формацию, сопровождающееся реокислением S—S-связей

мента, по существу, сводится к решению двух задач. Во-пер­вых, поиску условий, при которых инактивированный белок удается развернуть. Для разворачивания инактнвнрованных белков обычно используют те же реагенты, с помощью которых нативные (неинактивнрованные) белки можно перенести в со­стояние статистического клубка. Это концентриронамные раство­ры обратимых денатурантов (мочевины или гуанидинхлорида); если в белке имеются S—S-связи, то действие денату рантов усиливают добавлением тиолов — реагентов» расщепляющих S— S-связи. Во-вторых, экспериментальному подбору условий, в которых развернутый белок успешно сворачивается в нативную (каталитически активную) конформацию. Для этой цели часто полезными оказываются эффекторы ферментативной активно­сти (субстраты» ингибиторы, кофакторы и т. п.). которые од­новременно являются и эффекторами сворачивания, т. е. повы­шают выход реактивации фермента.

К настоящему времени, основываясь на описанной двух-стадийной процедуре, удалось реактивировать около десятка различны* ферментов. По-видимому, число примеров удачной реактивации «необратимо денатурированных» ферментов будет увеличиваться по мере накопления знаний об особенностях процессов денатурации и ренатурации (разворачивания и сво­рачивания) белков.

Возможность реактивации ферментов, инактивированных по другим, более сложным механизмам. В гл. 5 было отмечено, что такие процессы в белках, как диссоциация кофактора из

активного центра фермента, диссоциация олкгомерного белка на субъеднннцы, в принципе „являются обратимыми. Иными словами, эти процессы сами по себе не приводят к необра -тимому характеру инактивации» а лишь «запускают» другие» истинно необратимые процессы: агрегацию, ко валентные изме­нения в структуре белка, «необратимые» конформационные из­менения. Таким образом, вопрос о реактивации в таких более сложных случаях, по существу, сводится к одной из трех выше­перечисленных ситуаций: реактивации агрегированных белков, реактивации белков с измененной первичной структурой и ре­активации «необратимо денатурированных» ферментов или к различным комбинациям этих трех случаев.

§ 2. Регенерация кофакторов (коферментов}

К категории кофакторов относятся коферменты, простети-ческие группы и ионы металлов. С технологической точки зре­ния наибольший интерес представляет регенерация кофермен­тов. Коферменты — это низкомолекулярные органические соеди­нения, которые играют роль дополнительного субстрата в функ­ционировании многих ферментов. Примеры наиболее распро­страненных коферментов приведены ниже.

Формула Название

Окислительно-восстакоавтельные системы

NH,

он он

он он

(НАЛ)

—СН,—О—Р—О

I

-р-

(ФМН)

Неокмслнтельн о-в осстнновитеяьные системы

ОН ОН ОН О" О СН—СЬ—СН—СН,—0-4—О—Р'

штуклеопщ (♦АД)

(внгйминВ»)

Но он