Кул белка» не могут быть скомпенсированы за счет энергии образования слабых нековалентных взаимодействий

Ситуация существенно изменяется при включении ферментов в концентрированные полимерные гели. Здесь в силу стерических препятствий, вносимых частой пространственной сеткой полимера, поступательное и, возможно, вращательное движение белковых молекул существенно заторможено. В результате в таких систе­мах образование комплекса белок — матрица становится термо­динамически гораздо более выгодным, поскольку здесь уже не требуется затрат свободной энергии для погашения потерь посту­пательной и вращательной энтропии ферментной глобулы при ее сорбции на полимерной матрице. Благодаря этому в концентриро­ванных полимерных гелях становится возможным многоточечное взаимодействие (за счет слабых нековалентных сил) фермента с носителем^ поскольку в таких гелнх^полимерные цепи со всех сторон окружают ферментную глобулу. Такое многоточечное взаимодействие в гелевых системах действительно имеет место; оно приводит к существенной стабилизации ферментов. Так, а-химотрипсин, иековалентно включенный в заряженный гель по-лиметакриловой кислоты, в Ю⁵ раз более термостабилен, чем натнвный фермент, если концентрация полимерных цепей в геле составляет 50%.

Говоря о практическом применении гелевых систем, необхо­димо отметить один их существенный недостаток. Частички геля склонны к набуханию в воде, что приводит к снижению концент­рации полимерных цепей в геле. В результате эффект стабили­зации включенного в гель фермента может уменьшаться и даже вовсе исчезать, поскольку, как обсуждалось, для реали аза ции многоточечного не ко валентно го взаимодействия фермента с носи­телем необходимо, чтобы гель был достаточно концентрирован­ным. Поэтому практическую ценность с точки зрения повышен­ной стабильности препарата биокатализатора в суспензии имеют только те системы, в которых молекулы фермента включены в «сильное шитые»» не набухающие в воде гелевые частицы.

Многоточечное ко валентное присоединение фермента к по­верхности носителя (рис. 24, а). Другой путь у жестчения струк­туры фермента заключается в его иммобилизации на носителе с образованием большого числа ковалентных связей. Для реали­зации многоточечного взаимодействия необходимо, чтобы разме­ры ферментной глобулы и поры носителя соответствовали друг другу. Если проводить иммобилизацию белка на произвольно взятом носителе, то такое соответствие можно получить лишь случайно, поскольку поверхность носителя и поверхность белка имеют свои индивидуальные рельефы, в общем случае не комп­лементарные друг другу.

Этого недостатка лишен сополимеризационный метод иммоби­лизации, позволяющий создать полимерный носитель, комплемен­тарный молекуле фермента. Фермент химически модифици­руют (например, по аминогруппам) аналогом мономера, т.е.

Рис. 24. Схематическое изображение иммоби-лнэационных подходов к стабилизации ферментов

соединением, содержащим ненасыщенные связи (например, хло-рангидридом акриловой кислоты или акролеином). При после­дующей сополимеризации с мономером (например, с акрила-мидом кли метакрилатом натрия) белковая глобула формирует вокруг себя поверхность носителя, комплементарную собствен­ной, ковалентно к ней присоединяясь. Сополимеризационный ме­тод дает уникальную возможность получать препараты фермен­тов, пришитых различным числом ковалентных связей к поверх­ности носителя, за счет варьирования степени модификации на стадии обработки фермента аналогом мономера.

Ферменты, иммобилизованные по сополимеризационной мето­дике, обладают гораздо более высокой устойчивостью против инактивации при повышенных температурах, чем соответствую­щие нативные ферменты. Эффект стабилизации, определяемый как отношение констант скоростей необратимой инактивации нативного и иммобилизованного препаратов, возрастает с увели­чением числа связей между ферментом и носителем и достигает больших величин. Например, для а-химотрипсина, пришитого к носителю 15 связями, стабилизационный эффект составляет более 1000 раз. Такие ферментные препараты сохраняют ката­литическую активность при существенно более высоких темпе­ратурах. Так, например, оптимум эстеразной активности трип­сина, ковалентно вшитого в полиакриламндный гель 15 связями, наблюдается при температуре 75°С, что на 25° выше оптимума активности нативного фермента. Это указывает на резкое по­давление быстрых обратимых денатурационных процессов в иммобилизованном препарате.

Следует отметить, что эффект стабилизации для иммобили­зованного по сополимеризациониой методике фермента зависит только от числа ковалентных связей с носителем, но не зависит ни от плотности гелевого носителя (т.е. от концентрации поли­мера в геле), ни от степени его набухания. Более того, проводя сополимериза цнонную иммобилизацию в отсутствие бифункцио* нального сшивающего агента, удается получить водорастворимые

ферментные препараты, также обладающие повышенной термо­стабильностью.

Внутримолекулярное сшивание фермента бифункциональными реагентами (рис. 24,6). Модификация фгрмента бифункциональ­ными агентами в принципе может принести к наложению на белковую глобулу внутримолекулярных ковалентных сшивок. Следует ожидать, что сшивание увеличит конформацнонную жесткость белка и, следовательно, его стабильность. Этот подход (внутримолекулярное сшивание белка) активно используется в природе для увеличения стабильности белковых структур. К чис­лу «природных сшивок» относятся как ковалентные S—S-связи, так и нековалентные «солевые мостики», ионы Са^й+ и других металлов, связанные с молекулой белка, и т. п.

Успех или неудача при попытке повысить стабильность фер­мента обработкой бифункциональными реагентами в основном определяется соответствием длины реагента расстоянии") между возможными центрами пришивки на белковой глобуле. Очевидно, что для каждого конкретного белка существует оптимальный размер сшивающих агентов. Единственно надежный путь опре­деления размера подходящего реагента — эмпирический поиск. Для этого изучаемый фермент модифицируют соединениями гомологического ряда бифункциональных реагентов, например алифатических диаминов или имидоэфиров алифатических ди-карбоновых кислот, в условиях, когда не происходит межмоле­кулярного сшивания белковых молекул. Далее изучают зависи­мость стабилизационного эффекта от длины бифункционального реагента. Обычно такие зависимости имеют вид кривой с мак­симумом. Дело в том, что при модификации бифункциональным реагентом наряду с образованием «сшивок» происходит одното­чечная модификация функциональных групп белка. Соотношение этих двух процессов тем сильнее сдвинуто в сторону реакции сшивания, чем больше на поверхности белковой глобулы пар функциональных групп, расстояние между которыми примерно равно длине сшивающего агента. Именно в этом случае наблю­даются максимальные стабилизационные эффекты.

Следует отметить, что эмпирический характер поиска опти­мального сшивающего агента несколько снижает ценность мето­да внутримолекулярного сшивания белков для практических целей. Действительно, для каждого вновь взятого белка или при использовании нового гомологического ряда бифункциональных реагентов работу по подбору наилучшего сшивающего агента надо проводить заново.

Тем не менее метод сшивок весьма полезен, поскольку позво­ляет получать водорастворимые стабилизированные производные ферментов с относительно низкой молекулярной массой (срав­нимой с молекулярной массой самого фермента). Такие препа­раты предпочтительны в некоторых прикладных областях, в члетмоети в медицине