Или 0кислсш1ый)

сопряженный субстрат

Системы регенерации НАД на основе алкогольдегидроге-назы из печени лошади впервые были предложены Дж. Ван Ей-сом. Один из применяемых процессов — это процесс восстанов­ления л акт альдегида в пропан-1,2-диол:

Н⁺ + СН₃СН(ОН)СНО + НАДН «± СН_эСН(ОН)СН;гОН + НАД⁺

В присутствии сопряженного субстрата» этанола, число циклов НАД может достигать 800.

Разработаны также методы регенерации, основанные на дру­гих парах сопряженных субстратов» в частности циклогекса- под и я-нитрозо-М.Ы'-днметиланилин. Преимущество использо­вания этой пары заключается в возможности непрерывного слежения за реакцией восстановления п- нитрозо-N, N'-дн мети л -анилина.

Недостатки использования сопряженных субстратов в процес­сах регенерации НАД связаны с тем, что, во-первых, равновесие реакции альдегид *~ спирт сильно сдвинуто в сторону спирта (что Ype6yeT высоких концентраций сопряженного субстрата) и, во-вторых, выделение основного продукта из смеси затрудне­но. Применение известных методов иммобилизации ферментов и коферментов будет способствовать преодолению возникшей проблемы.

Использование сопряженных ферментативных реакций. Суть этого способа регенерации заключается в том, что в реакцию, катализируемую ферментом А, дополнительно вводится фер­мент Б, в функционировании которого участвует сопряженная форма кофермента:

ФрмцтЛ

основной субстрат ----- j— - -^—*- основной продукт

/ \

кофактор / \ кофактор

(восстановленный [ ] (окнсюилый или

или окисленный) \ /)

v фермент Б /

побочный продукт -•—^ *--------- эстхйиогательный субсграт

Существенным для данного способа регенерации кофермента является различие в специфичности используемых ферментов для исключения возможной конкуренции основных и побочных субстратов и продуктов.

В числе удачных систем регенерации НАД могут быть назва­ны системы лактатдегидрогеназа —■ глутаматдегидрогеназа и лактатдегидрогеназа — алкогольдегидрогеназа. Так, включение последней системы позволяет провести десятки тысяч циклов регенерации НАД.

В последние годы системы сопряженных ферментативных реакции находят все большее применение в тонком органи­ческом синтезе, В качестве примера назовем реакцию окисле­ния стероидов в присутствии 17-р-оксистероиддегидрогеназы. Н2

Для регенерации окисленной формы НАД используется ката­лизируемое лактатдегидрогеназой восстановление пи^увата.

Для придания большей технологичности промышленным про­цессам разрабатываются процессы регенерации, основанные на применении иммобилизованных ферментов и (или) коферментов. Так, процесс регенерации НАД был осуществлен при использо­вании иммобилизованных в полупроницаемых микрокапсулах алкогольдегидрогеназы и малатдегидрогеназы. Наряду с им­мобилизованными ферментами употребляется и иммобилизован­ный НАД, например, связанный с растворимыми производными декстрана.

Для того чтобы система регенерации коферментов была эко­номически выгодной, необходимо понизить стоимость вспомога­тельного субстрата. Это было сделано с применением процес­са на основе формиатдегидрогеназы и НАДН-дегидрогеназы (А. М. Егоров, А. П. Осипов, 1978).

НАЛ

рф рф

О&осстановненнын) (окисленный)

Неферментативные способы регенерацк НАД(Н) и НАДФ(Н), К неферментативным методам регенерации кофак­торов относятся химические и электрохимические способы. Ввиду своей низкой специфичности они меньше распространены, чем ферментативные.

Химические методы. В качестве химических реагентов для регенерации НАДН находят применение дитионит натрия и некоторые соли пиридиння. Преимущество проведения регенера­ции в присутствии этих веществ заключается в их относи­тельно невысокой стоимости. Однако следует отметить, что и дитионит натрия, и пиридиниевые холи могут являться ингиби­торами ряда ферментов.

В последнее время в качестве реагента для химической регенерации НАД применяется сравнительно дешевый флавин-мононуклеотид (ФМН). Использование этого вещества обуслов­лено тем, что флавиновые коферменты участвуют в процессах регенерации НАД in vivo. Иммобилизация ФМН на полиэти-лени мине приводит к существенному увеличению скорости окис­ления НАДН.

Удобным оказалось применять для регенерации пиридинди-нуклеотидных коферментов различные красители, которые дают возможность определять малые количества коферментов- Среди красителей наиболее употребимы метиленовый голубой, тиазолил

голубой, акрифлавин, феназинметосульфат. Так, при использова­нии последнего достигается до 10 000 циклов восстановления кофер мента.

Электрохимические методы регенерации кофер ментов только начинают развиваться. При проведении прямого электрохими­ческого восстановления или окисления кофермента могут возни­кать трудности, связанные с появлением ферментативно неак­тивных форм в результате, например, его димернзации. Для преодоления этих трудностей проводят электрохимическое вос­становление иммобилизованного НАД. В качестве носителя ис­пользуют водорастворимую альгиновую кислоту.

Регенерация АТФ, АТФ — один из важных коферментов, участвующих в ферментативных процессах образования новых химических связей. Для регенерации АТФ применяют следую­щие методы: I — прямой химический синтез из АМФ или АДФ и фосфорной кислоты; 2 — получение АТФ in vivo с использова­нием дрожжей, бактерии, клеточных органелл; 3 — фермента­тивный синтез in vitro.

Химический синтез АТФ. Осуществляется путем фосфорили рования аденозина или АМФ. В качестве фосфорилирующих агентов употребляются фосфор ил хлорид, фосфорная кислота и др. Реакция протекает в органическом растворителе. Хими­ческий метод регенерации АТФ не очень удобен из-за обра­зования побочных продуктов, необходимости применения боль­шого избытка фосфорилирующего агента, в также из-за необ­ходимости дальнейшей очистки АТФ.

Регенерация АТФ с использованием целых- клеток и орга- иелл. Многие клетки и клеточные органеллы содержат Ф^€Р~ менты, катализирующие синтез АТФ из аденозина, АМФ и неорганического фосфата- Так, для регенерации АТФ использу­ются дрожжи, а также субклеточные органеллы, такие, как митохондрии, хлоропласты и хроматофоры. В последние годы для регенерации АТФ начали применять иммобилизованные клетки.

Процесс регенерацит АТФ, происходящий с участием мито­хондрий, может быть в сумме представлен следующим образом:

2НАДН + 2Н+ + 6АДФ + № + O₂ -+ 2НАД+ + 8H₂O + 2 пируват + ЗОАДФ + ЗОР, + 50;-^ 6СО₂ + 34Н₂О 4- ЗОАТФ

К недостаткам этого процесса относятся: 1 — низкая стабиль­ность систем; 2 — необходимость создания дополнительной си­стемы регенерации НАД, участвующего в первой реакции.

Значительно более перспективным в регенерации АТФ яв­ляется использование хроматофоров, способных осуществлять реакцию циклического фосфорилирования. Преимуществом хро-матофоров по сравнению с митохондриями и хлоропластамн